| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 一 前言 | 第13-25页 |
| 1.1 棉花概述 | 第13-15页 |
| 1.1.1 棉纤维 | 第13-14页 |
| 1.1.2 棉纤维品质 | 第14页 |
| 1.1.3 棉纤维的生长发育 | 第14-15页 |
| 1.2 棉花纤维生长发育的分子调控机理 | 第15-17页 |
| 1.2.1 纤维原始细胞分化与突起相关基因 | 第15-16页 |
| 1.2.2 棉纤维细胞伸长发育相关基因 | 第16页 |
| 1.2.3 棉纤维细胞次生壁合成与增厚期相关基因 | 第16-17页 |
| 1.2.4 棉纤维细胞脱水成熟期相关基因 | 第17页 |
| 1.2.5 棉纤维发育的模式调控途径 | 第17页 |
| 1.3 HD-ZIP转录因子 | 第17-20页 |
| 1.3.1 HD-ZIP Ⅳ转录因子的结构特点 | 第18页 |
| 1.3.2 HD-ZIP Ⅳ基因家族的介绍 | 第18-19页 |
| 1.3.3 HD-ZIP Ⅳ基因家族调控棉花纤维的生长发育 | 第19-20页 |
| 1.4 启动子 | 第20-23页 |
| 1.4.1 启动子概述 | 第20-21页 |
| 1.4.2 启动子研究方法 | 第21-23页 |
| 1.4.2.1 生物信息学分析 | 第21页 |
| 1.4.2.2 缺失突变 | 第21页 |
| 1.4.2.3 定点突变 | 第21页 |
| 1.4.2.4 瞬时表达分析 | 第21-22页 |
| 1.4.2.5 稳定转化分析 | 第22页 |
| 1.4.2.6 酵母单杂交 | 第22-23页 |
| 1.5 SMA-4 突变体 | 第23-25页 |
| 二 GaHD1基因启动子的克隆及结构与功能分析 | 第25-46页 |
| 2.1 试验材料 | 第25页 |
| 2.1.1 试验仪器 | 第25页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第25页 |
| 2.1.3 培养基（以 1L为计） | 第25页 |
| 2.2 GaHD1基因启动子的克隆 | 第25-27页 |
| 2.2.1 亚洲棉4号DNA提取 | 第25-26页 |
| 2.2.2 GaHD1基因启动子全长引物设计 | 第26页 |
| 2.2.3 PCR扩增GaHD1基因启动子全长 | 第26-27页 |
| 2.2.3.1 PCR反应体系 | 第26页 |
| 2.2.3.2 PCR反应条件 | 第26-27页 |
| 2.2.4 PCR产物回收 | 第27页 |
| 2.3 GaHD1基因启动子的Motif分析 | 第27页 |
| 2.4 GaHD1启动子分段克隆 | 第27-28页 |
| 2.4.1 GaHD1启动子分段引物的设计 | 第27-28页 |
| 2.4.2 PCR分段扩增GaHD1启动子序列 | 第28页 |
| 2.4.3 PCR产物回收 | 第28页 |
| 2.5 分段克隆启动子与GUS融合载体的重组及鉴定 | 第28-32页 |
| 2.5.1 pCXSN1262载体的准备 | 第28-29页 |
| 2.5.1.1 pCXSN1262载体 | 第28-29页 |
| 2.5.1.2 pCXSN1262载体的酶切 | 第29页 |
| 2.5.1.3 pCXSN1262载体的胶回收 | 第29页 |
| 2.5.2 目的基因产物与pCXSN1262载体的连接 | 第29-30页 |
| 2.5.3 重组体转化E.Coli | 第30页 |
| 2.5.4 筛选阳性菌落 | 第30页 |
| 2.5.5 获得重组质粒 | 第30-31页 |
| 2.5.6 GV3101农杆菌感受态的制备 | 第31页 |
| 2.5.7 重组质粒转化GV3101农杆菌 | 第31-32页 |
| 2.6 拟南芥的遗传转化及筛选 | 第32-33页 |
| 2.6.1 拟南芥的种植 | 第32页 |
| 2.6.2 转化拟南芥 | 第32页 |
| 2.6.3 阳性植株的筛选与鉴定 | 第32-33页 |
| 2.6.4 转基因纯合植株的获得 | 第33页 |
| 2.7 转基因拟南芥的GUS组织染色及活性检测 | 第33-35页 |
| 2.7.1 GUS染液的配制 | 第33页 |
| 2.7.1.1 200mL X－Gluc Buffer基液（pH 7.0）的配制 | 第33页 |
| 2.7.1.2 X－Gluc母液的配制 | 第33页 |
| 2.7.1.3 染色液配制 | 第33页 |
| 2.7.2 转基因拟南芥GUS染色 | 第33页 |
| 2.7.2.1 植物组织固定 | 第33页 |
| 2.7.2.2 植物组织染色 | 第33页 |
| 2.7.2.3 植物组织脱色 | 第33页 |
| 2.7.3 GUS相对活性检测 | 第33-35页 |
| 2.7.3.1 溶液配制 | 第34页 |
| 2.7.3.2 标准曲线的制备 | 第34-35页 |
| 2.7.3.3 样品蛋白的提取 | 第35页 |
| 2.7.3.4 样品蛋白含量的测定 | 第35页 |
| 2.7.3.5 GUS酶活性测定 | 第35页 |
| 2.7.3.6 整理所测得的数据，计算GUS酶活性 | 第35页 |
| 2.8 HD1-Pro-full Length转基因拟南芥石蜡切片 | 第35-37页 |
| 2.8.1 实验所需试剂 | 第35页 |
| 2.8.2 植物组织固定 | 第35-36页 |
| 2.8.3 植物组织处理 | 第36页 |
| 2.8.3.1 脱水 | 第36页 |
| 2.8.3.2 透明 | 第36页 |
| 2.8.3.3 浸蜡 | 第36页 |
| 2.8.3.4 包埋 | 第36页 |
| 2.8.4 切片 | 第36页 |
| 2.8.5 粘片 | 第36页 |
| 2.8.6 脱蜡 | 第36-37页 |
| 2.8.7 胶封观察 | 第37页 |
| 2.9 5μM GA3处理转基因拟南芥的GUS组织染色及活性检测 | 第37页 |
| 2.9.1 5μM GA3处理转基因拟南芥 | 第37页 |
| 2.9.2 GUS染液的配制 | 第37页 |
| 2.9.3 转基因拟南芥GUS染色 | 第37页 |
| 2.9.4 GUS相对活性检测 | 第37页 |
| 2.10 结果与分析 | 第37-44页 |
| 2.10.1 GaHD1基因启动子的确定 | 第37页 |
| 2.10.2 GaHD1启动子Motif分析结果 | 第37-38页 |
| 2.10.3 GaHD1启动子分段克隆凝胶检测 | 第38-39页 |
| 2.10.4 pGaHD1：GUS融合表达菌液鉴定 | 第39页 |
| 2.10.5 pGaHD1：GUS融合表达转基因植株鉴定 | 第39-40页 |
| 2.10.6 转基因植株GUS检测 | 第40-41页 |
| 2.10.7 GUS活力检测 | 第41-42页 |
| 2.10.8 HD1-Pro-full Length转基因拟南芥石蜡切片 | 第42页 |
| 2.10.9 5 μM GA3处理后GUS染色结果 | 第42-43页 |
| 2.10.10 5 μM GA3处理后GUS活力检测结果 | 第43-44页 |
| 2.11 小结与讨论 | 第44-46页 |
| 三 GaHD1基因上游调控转录因子的体外验证 | 第46-58页 |
| 3.1 试验材料 | 第46-47页 |
| 3.1.1 试验仪器 | 第46页 |
| 3.1.2 试验试剂 | 第46-47页 |
| 3.1.3 培养基 | 第47页 |
| 3.2 试验方法 | 第47-49页 |
| 3.2.1 克隆已知的与棉纤维发育相关的转录调节因子（GaHD1，GaHOX3，GaPDF2，GaMML9） | 第47页 |
| 3.2.1.1 基因全长引物设计 | 第47页 |
| 3.2.1.2 PCR扩增基因全长 | 第47页 |
| 3.2.1.3 PCR产物回收 | 第47页 |
| 3.2.2 基因全长与克隆载体的连接 | 第47-48页 |
| 3.2.2.1 PCY载体的准备 | 第48页 |
| 3.2.2.2 目的基因产物与PCY载体的连接 | 第48页 |
| 3.2.3 重组载体转化E.Coli | 第48页 |
| 3.2.4 获得重组质粒 | 第48页 |
| 3.2.5 拟南芥原生质体制备 | 第48-49页 |
| 3.2.5.1 拟南芥种植 | 第49页 |
| 3.2.5.2 制备原生质体 | 第49页 |
| 3.2.6 拟南芥原生质体转化 | 第49页 |
| 3.2.7 GFP标签表达 | 第49页 |
| 3.3 GaHD1启动子的酵母单杂交 | 第49-52页 |
| 3.3.1 pBait-ABAi载体的构建 | 第50页 |
| 3.3.2 重组质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株 | 第50-51页 |
| 3.3.2.1 线性化酵母单杂交诱饵质粒 | 第50-51页 |
| 3.3.2.2 酵母感受态细胞的制备 | 第51页 |
| 3.3.2.3 pBait-ABAi载体转化酵母感受态细胞 | 第51页 |
| 3.3.3 Bait酵母菌株的自激活检测 | 第51-52页 |
| 3.3.4 酵母感受态制备及转化 | 第52页 |
| 3.3.4.1 酵母感受态制备 | 第52页 |
| 3.3.4.2 酵母感受态转化（载体为pGADT7） | 第52页 |
| 3.4 结果与分析 | 第52-56页 |
| 3.4.1 棉纤维发育关键基因的克隆 | 第52页 |
| 3.4.2 重组质粒凝胶检测 | 第52-53页 |
| 3.4.3 基因的亚细胞定位 | 第53页 |
| 3.4.4 酵母菌株检测 | 第53-54页 |
| 3.4.5 质粒载体线性化 | 第54页 |
| 3.4.6 酵母转化及筛选结果分析 | 第54-55页 |
| 3.4.7 抗菌素ABAi工作浓度的确定结果分析 | 第55页 |
| 3.4.8 酵母单杂互作结果分析 | 第55-56页 |
| 3.5 小结与讨论 | 第56-58页 |
| 四 GaHD1基因上游调控转录因子的体内验证 | 第58-65页 |
| 4.1 试验材料 | 第58页 |
| 4.1.1 试验仪器 | 第58页 |
| 4.1.2 试验试剂 | 第58页 |
| 4.2 烟草瞬时转化 | 第58-61页 |
| 4.2.1 基因全长与克隆载体的连接 | 第58-59页 |
| 4.2.1.1 pCXSN1250载体 | 第58-59页 |
| 4.2.1.2 pCXSN1250的酶切 | 第59页 |
| 4.2.1.3 pCXSN1250载体的胶回收 | 第59页 |
| 4.2.2 重组质粒与pCXSN1250载体的连接 | 第59页 |
| 4.2.3 重组载体转化E.Coli | 第59页 |
| 4.2.4 获得重组质粒 | 第59页 |
| 4.2.5 重组质粒转化GV3101农杆菌 | 第59-60页 |
| 4.2.6 烟草瞬时转化 | 第60-61页 |
| 4.2.6.1 烟草种植 | 第60页 |
| 4.2.6.2 烟草注射 | 第60-61页 |
| 4.2.7 烟草GUS染色及活力检测 | 第61页 |
| 4.2.7.1 烟草GUS染色 | 第61页 |
| 4.2.7.2 烟草GUS相对活性检测 | 第61页 |
| 4.3 结果与分析 | 第61-63页 |
| 4.3.1 pCXSN1250酶切检测 | 第61页 |
| 4.3.2 阳性农杆菌检测 | 第61-62页 |
| 4.3.3 烟草GUS染色结果 | 第62-63页 |
| 4.3.4 烟草GUS活力检测结果 | 第63页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第63-65页 |
| 五 总结与展望 | 第65-67页 |
| 5.1 总结 | 第65页 |
| 5.2 研究的创新点 | 第65-66页 |
| 5.3 展望 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-74页 |
| 附录一 | 第74-78页 |
| 附录二 | 第78-80页 |
| 个人简介 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
