| 中文摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-42页 |
| 1.1 核黄素的理化性质、功能、用途及工业化生产 | 第11-13页 |
| 1.1.1 核黄素的理化性质、功能和用途 | 第11-12页 |
| 1.1.2 核黄素的工业化生产 | 第12-13页 |
| 1.2 B.subtilis核黄素生物合成研究进展 | 第13-20页 |
| 1.2.1 B.subtilis核黄素生产菌株 | 第13-14页 |
| 1.2.2 B.subtilis核黄素生物合成代谢工程策略 | 第14-20页 |
| 1.3 核黄素生物合成途径代谢调节机制 | 第20-27页 |
| 1.3.1 rib操纵子与核黄素合成途径 | 第20-23页 |
| 1.3.2 Riboswitch调控机制 | 第23-24页 |
| 1.3.3 RFN元件与rib操纵子转录调控 | 第24-26页 |
| 1.3.4 ribC和ribR基因 | 第26-27页 |
| 1.4 嘌呤生物合成途径代谢调控机制 | 第27-32页 |
| 1.4.1 嘌呤操纵子结构及生物合成途径 | 第27-28页 |
| 1.4.2 嘌呤合成途径转录水平抑制机制 | 第28-30页 |
| 1.4.3 嘌呤合成途径代谢物反馈抑制机制 | 第30-32页 |
| 1.5 B.subtilis无痕遗传操作技术研究进展 | 第32-40页 |
| 1.5.1 基于操作子-抑制子系统的遗传修饰策略 | 第33-34页 |
| 1.5.2 基于嘧啶代谢的遗传修饰策略 | 第34-35页 |
| 1.5.3 基于营养缺陷的遗传修饰策略 | 第35-36页 |
| 1.5.4 基于位点特异性重组的遗传修饰策略 | 第36-38页 |
| 1.5.5 基于毒蛋白的遗传修饰策略 | 第38-40页 |
| 1.6 本文的主要技术路线 | 第40-42页 |
| 1.6.1 选题背景 | 第40页 |
| 1.6.2 技术路线与研究内容 | 第40-42页 |
| 第二章 枯草芽孢杆菌高效无痕遗传修饰系统的开发 | 第42-93页 |
| 2.1 实验材料 | 第43-47页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第43-44页 |
| 2.1.2 培养基 | 第44页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第44-45页 |
| 2.1.4 实验药品 | 第45-46页 |
| 2.1.5 实验溶剂 | 第46-47页 |
| 2.2 实验方法 | 第47-57页 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第47-49页 |
| 2.2.2 一步法制备及转化大肠杆菌感受态细胞 | 第49页 |
| 2.2.3 碱裂解法提取大肠杆菌或枯草芽孢杆菌质粒 | 第49页 |
| 2.2.4 枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取 | 第49-50页 |
| 2.2.5 枯草芽孢杆菌Spizizen转化 | 第50-51页 |
| 2.2.6 ComK诱导枯草芽孢杆菌感受态的制备及转化 | 第51页 |
| 2.2.7 PCR体系 | 第51-54页 |
| 2.2.8 琼脂糖凝胶电泳 | 第54页 |
| 2.2.9 DNA片段的回收和纯化 | 第54-55页 |
| 2.2.10 酶切体系 | 第55页 |
| 2.2.11 连接体系 | 第55-56页 |
| 2.2.12 基因定点突变 | 第56-57页 |
| 2.2.13 引物的设计和基因测序 | 第57页 |
| 2.3 结果与分析 | 第57-92页 |
| 2.3.1 枯草芽孢杆菌高效无痕遗传修饰系统的原理 | 第57-59页 |
| 2.3.2 无痕遗传操作通用载体的构建 | 第59-64页 |
| 2.3.3 无痕遗传操作基础菌株BUK的构建 | 第64-67页 |
| 2.3.4 ccpN无痕等位基因置换 | 第67-72页 |
| 2.3.5 ileS无痕等位基因置换 | 第72-75页 |
| 2.3.6 ccpN无痕基因敲除 | 第75-79页 |
| 2.3.7 20.5 kb无痕大片段敲除 | 第79-85页 |
| 2.3.8 75.9 kb无痕大片段敲除 | 第85-90页 |
| 2.3.9 无痕遗传修饰系统效率验证 | 第90-92页 |
| 2.4 本章小结 | 第92-93页 |
| 第三章 基于全基因组尺度的逆向代谢工程菌株重构 | 第93-114页 |
| 3.1 实验材料 | 第94-96页 |
| 3.1.1 菌种和质粒 | 第94-95页 |
| 3.1.2 培养基 | 第95页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第95页 |
| 3.1.4 实验药品和溶剂 | 第95-96页 |
| 3.2 实验方法 | 第96页 |
| 3.2.1 菌体生长特性的考察和摇瓶发酵条件 | 第96页 |
| 3.2.2 发酵液中核黄素和残糖的测定 | 第96页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第96-113页 |
| 3.3.1 基于全基因组测序有利突变点筛选结果 | 第96-97页 |
| 3.3.2 基础菌株BSW4构建 | 第97-98页 |
| 3.3.3 ribC点突变引入 | 第98-100页 |
| 3.3.4 ribG~-突变引入 | 第100-102页 |
| 3.3.5 yhcF突变引入 | 第102-104页 |
| 3.3.6 yvrH突变引入 | 第104-106页 |
| 3.3.7 ywaA突变引入 | 第106-107页 |
| 3.3.8 purA突变引入 | 第107-109页 |
| 3.3.9 ccpN突变引入 | 第109-111页 |
| 3.3.10 逆向重构菌株核黄素合成能力分析 | 第111-113页 |
| 3.4 本章小结 | 第113-114页 |
| 第四章 核黄素合成途径解调对枯草芽孢杆菌核黄素合成的影响 | 第114-129页 |
| 4.1 实验材料 | 第114-115页 |
| 4.1.1 菌种和质粒 | 第114-115页 |
| 4.1.2 培养基 | 第115页 |
| 4.1.3 实验仪器 | 第115页 |
| 4.1.4 实验药品和溶剂 | 第115页 |
| 4.2 实验方法 | 第115-118页 |
| 4.2.1 RNA的提取方法 | 第115-116页 |
| 4.2.2 RT-PCR分析方法 | 第116-118页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第118-128页 |
| 4.3.1 P_(43)-ribA过表达 | 第118-120页 |
| 4.3.2 P_(43)-ribG过表达 | 第120-123页 |
| 4.3.3 ribO敲除组成型表达 | 第123-124页 |
| 4.3.4 RT-PCR验证核黄素操纵子的转录解调 | 第124-126页 |
| 4.3.5 核黄素操纵子解调对核黄素产量的影响 | 第126-127页 |
| 4.3.6 核黄素操纵子解调对菌株生理的影响 | 第127-128页 |
| 4.4 本章小结 | 第128-129页 |
| 第五章 嘌呤合成途径解调对枯草芽孢杆菌核黄素合成的影响 | 第129-161页 |
| 5.1 实验材料 | 第130-131页 |
| 5.1.1 菌种和质粒 | 第130页 |
| 5.1.2 培养基 | 第130-131页 |
| 5.1.3 实验仪器 | 第131页 |
| 5.1.4 实验药品和溶剂 | 第131页 |
| 5.2 实验方法 | 第131-134页 |
| 5.2.1 蛋白质浓度的测定-Bradford法 | 第131-132页 |
| 5.2.2 PRPP转酰胺酶酶活力测定 | 第132页 |
| 5.2.3 胞内代谢物测定 | 第132-134页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第134-160页 |
| 5.3.1 purR敲除 | 第134-136页 |
| 5.3.2 -10区突变 | 第136-138页 |
| 5.3.3 Riboswitch敲除 | 第138-141页 |
| 5.3.4 P_(43)-purF过表达 | 第141-143页 |
| 5.3.5 purF定点突变引入 | 第143-147页 |
| 5.3.6 外源purF~*(eco)过表达 | 第147-150页 |
| 5.3.7 RT-PCR验证嘌呤合成途径解调效果 | 第150-152页 |
| 5.3.8 转录水平解调对工程菌株生理和核黄素产量影响 | 第152-153页 |
| 5.3.9 PRPP转酰胺酶突变酶活性分析 | 第153-154页 |
| 5.3.10 PurF突变酶对工程菌株生理和核黄素产量影响 | 第154-156页 |
| 5.3.11 嘌呤核苷代谢物对PRPP转酰胺酶突变酶反馈抑制效果分析 | 第156-157页 |
| 5.3.12 胞内嘌呤核苷类物质浓度分析 | 第157-160页 |
| 5.4 本章小结 | 第160-161页 |
| 第六章 结论与展望 | 第161-164页 |
| 6.1 主要结论 | 第161-162页 |
| 6.2 创新点 | 第162页 |
| 6.3 展望 | 第162-164页 |
| 参考文献 | 第164-177页 |
| 发表论文和科研情况 | 第177-179页 |
| 附录 | 第179-181页 |
| 致谢 | 第181页 |
