| 致谢 | 第4-11页 |
| 摘要 | 第11-14页 |
| 文献综述 | 第14-29页 |
| 1 鸭源鸡杆菌 | 第14-21页 |
| 1.1 病原学 | 第14-15页 |
| 1.1.1 分类地位 | 第14页 |
| 1.1.2 理化特性 | 第14-15页 |
| 1.2 禽类鸭源鸡杆菌感染现状 | 第15-16页 |
| 1.3 鸭源鸡杆菌种群演化动态 | 第16-17页 |
| 1.4 鸭源鸡杆菌的传播途径 | 第17页 |
| 1.5 鸭源鸡杆菌的致病性 | 第17-19页 |
| 1.6 临床症状及病理变化 | 第19-20页 |
| 1.7 分子生物学检测诊断方法 | 第20-21页 |
| 1.7.1 聚合酶链式反应 | 第20页 |
| 1.7.2 荧光原位杂交 | 第20-21页 |
| 1.7.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 | 第21页 |
| 2 鸭源鸡杆菌毒力因子及其致病机理研究进展 | 第21-27页 |
| 2.1 菌毛 | 第21-22页 |
| 2.2 荚膜 | 第22页 |
| 2.3 生物被膜 | 第22-23页 |
| 2.4 外膜囊泡 | 第23页 |
| 2.5 RTX样毒素GtxA | 第23-25页 |
| 2.6 金属蛋白酶 | 第25页 |
| 2.7 血凝素 | 第25页 |
| 2.8 耐药因子 | 第25-27页 |
| 3 细菌外膜蛋白W的研究进展 | 第27-29页 |
| 3.1 概述 | 第27页 |
| 3.2 增强细菌环境适应能力 | 第27页 |
| 3.3 参与耐药性的形成 | 第27-28页 |
| 3.4 具有免疫原性 | 第28页 |
| 3.5 与细菌致病性相关 | 第28-29页 |
| 3.6 抵抗宿主天然免疫防御 | 第29页 |
| 本研究目的和意义 | 第29-30页 |
| 第一部分 鸭源鸡杆菌ompW基因缺失株的构建及 | 第30-47页 |
| 1 引言 | 第30页 |
| 2 材料与方法 | 第30-40页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第30页 |
| 2.2 培养基及主要试剂 | 第30页 |
| 2.3 主要仪器 | 第30-31页 |
| 2.4 主要培养基及溶液的配制 | 第31-32页 |
| 2.4.1 M-IV液体培养基 | 第31页 |
| 2.4.2 SDS-PAGE缓冲液 | 第31-32页 |
| 2.4.3 Western Blotting缓冲液 | 第32页 |
| 2.5 方法 | 第32-40页 |
| 2.5.1 菌种复苏及细菌基因组DNA提取 | 第32页 |
| 2.5.2 质粒提取 | 第32页 |
| 2.5.3 鸭源鸡杆菌ompW突变菌株的构建 | 第32-37页 |
| 2.5.4 鸭源鸡杆菌突变株ΔompW鉴定 | 第37-38页 |
| 2.5.5 菌株的生长特性研究 | 第38-39页 |
| 2.5.6 菌株溶血活性及生长形态观察 | 第39页 |
| 2.5.7 自身凝集测定 | 第39页 |
| 2.5.8 MIC测定 | 第39-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-45页 |
| 3.1 扩增出ompW基因上下游同源臂及Cmp抗性基因 | 第40页 |
| 3.2 成功构建出质粒pUC18-ompW-U-C-D | 第40-41页 |
| 3.3 鸭源鸡杆菌突变株ΔompW的鉴定 | 第41-43页 |
| 3.3.1 PCR扩增出Cmp抗性基因及ompW基因的两端片段 | 第41-42页 |
| 3.3.2 细菌外膜蛋白的SDS-PAGE分析 | 第42页 |
| 3.3.3 Western Blotting检测证明ΔompW不表达OmpW | 第42-43页 |
| 3.4 ΔompW与其亲本株生长性能相似 | 第43页 |
| 3.5 RZ和ΔompW菌株溶血活性及生长形态未变 | 第43-44页 |
| 3.6 ΔompW自身凝集能力下降 | 第44页 |
| 3.7 ΔompW对四环素类药物敏感性显著升高 | 第44-45页 |
| 4 讨论与结论 | 第45-47页 |
| 4.1 应用自然转化法成功构建出鸭源鸡杆菌突变株△ompW | 第45页 |
| 4.2 OmpW在鸭源鸡杆菌抵抗四环素中发挥重要作用 | 第45-47页 |
| 第二部分 RZ与ΔompW的抗应激研究 | 第47-57页 |
| 1 引言 | 第47页 |
| 2 材料与方法 | 第47-51页 |
| 2.1 菌株 | 第47页 |
| 2.2 培养基及主要试剂 | 第47页 |
| 2.3 主要仪器 | 第47-48页 |
| 2.4 方法 | 第48-51页 |
| 2.4.1 菌种复苏与培养 | 第48页 |
| 2.4.2 不同盐度下的生长特性 | 第48页 |
| 2.4.3 不同盐度下OMPs的SDS-PAGE分析 | 第48页 |
| 2.4.4 不同盐度下OmpW的Western Blotting分析 | 第48页 |
| 2.4.5 Real-time PCR分析不同盐度下细菌OmpW mRNA转录水平 | 第48-50页 |
| 2.4.6 细菌的应激抵抗力测定 | 第50-51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-55页 |
| 3.1 ΔompW的生长受高渗透环境影响更大 | 第51页 |
| 3.2 高渗透压下G.anatis OmpW表达上调 | 第51-52页 |
| 3.3 鸭源鸡杆菌OmpW mRNA相对转录水平分析 | 第52-55页 |
| 3.4 ompW缺失降低了应激抵抗力 | 第55页 |
| 4 讨论与结论 | 第55-57页 |
| 4.1 OmpW是鸭源鸡杆菌调节NaCl所必需的 | 第55-56页 |
| 4.2 OmpW与鸭源鸡杆菌耐氧化及热应激有一定相关性 | 第56-57页 |
| 第三部分 RZ与ΔompW的血清杀菌机制的初步探究 | 第57-63页 |
| 1 引言 | 第57页 |
| 2 材料与方法 | 第57-59页 |
| 2.1 菌株 | 第57页 |
| 2.2 主要试剂和培养基 | 第57页 |
| 2.3 主要仪器 | 第57页 |
| 2.4 方法 | 第57-59页 |
| 2.4.1 菌种复苏 | 第57页 |
| 2.4.2 血清的制备 | 第57-58页 |
| 2.4.3 不同浓度血清中的生存率比较 | 第58页 |
| 2.4.4 不同浓度血清条件下OmpW的Western Blotting分析 | 第58页 |
| 2.4.6 不同浓度血清中鸭源鸡杆菌OmpW mRNA转录水平的变化 | 第58页 |
| 2.4.7 血清杀菌通路的初步探究 | 第58-59页 |
| 3 结果与分析 | 第59-61页 |
| 3.1 OmpW缺失使血清杀菌能力下降 | 第59页 |
| 3.2 抵抗血清杀菌时OmpW表达上调 | 第59-60页 |
| 3.3 抵抗血清杀菌时OmpW mRNA转录上调 | 第60-61页 |
| 3.4 鸭源鸡杆菌通过旁路通路激活补体系统 | 第61页 |
| 4 讨论与结论 | 第61-63页 |
| 4.1 OmpW在鸭源鸡杆菌血清杀菌中发挥重要作用 | 第61-62页 |
| 4.2 OmpW抑制补体旁路通路发挥耐血清杀菌活性 | 第62-63页 |
| 第四部分 RZ与ΔompW致病力的研究 | 第63-71页 |
| 1 引言 | 第63页 |
| 2 材料与方法 | 第63-65页 |
| 2.1 菌株和试验动物 | 第63页 |
| 2.2 主要试剂 | 第63页 |
| 2.3 细菌培养 | 第63页 |
| 2.4 小鼠半数致死量(LD_(50))的测定 | 第63-64页 |
| 2.5 对小鼠致病力分析 | 第64页 |
| 2.6 鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞黏附性定 | 第64页 |
| 2.6.1 鸡输卵管原代细胞的制备与培养 | 第64页 |
| 2.6.2 鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞体黏附测定 | 第64页 |
| 2.7 生物被膜形成测定 | 第64-65页 |
| 2.7.1 生物被膜的培养 | 第64-65页 |
| 2.7.2 结晶紫染色法定量测定生物被膜形成量 | 第65页 |
| 3 结果与分析 | 第65-69页 |
| 3.1 OmpW缺失使G.anatis对小鼠的LD_(50)提高 | 第65页 |
| 3.2 RZ与ΔompW对小鼠的致病性无显著差异 | 第65-67页 |
| 3.3 RZ和ΔompW对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力相似 | 第67页 |
| 3.4 RZ和ΔompW生物被膜形成能力相似 | 第67-69页 |
| 4 讨论与结论 | 第69-71页 |
| 4.1 OmpW缺失后不影响鸭源鸡杆菌对小鼠的致病力 | 第69页 |
| 4.2 OmpW参与鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附 | 第69页 |
| 4.3 OmpW对鸭源鸡杆菌生物被膜形成影响很小 | 第69-71页 |
| 第五部分 鸭源鸡杆菌flfA缺失菌株的构建及其生物学特性研究 | 第71-80页 |
| 1 引言 | 第71页 |
| 2 材料与方法 | 第71-75页 |
| 2.1 菌株与质粒 | 第71页 |
| 2.2 培养基及主要试剂 | 第71页 |
| 2.3 主要仪器 | 第71页 |
| 2.4 主要溶液的配制 | 第71页 |
| 2.5 方法 | 第71-75页 |
| 2.5.1 菌种复苏及鸭源鸡杆菌基因组的提取 | 第71页 |
| 2.5.2 质粒提取 | 第71-72页 |
| 2.5.3 鸭源鸡杆菌flfA突变菌株的构建 | 第72-73页 |
| 2.5.3 Cmp抗性盒子的扩增及鉴定 | 第73页 |
| 2.5.4 PCR扩增flfA基因上下游同源臂 | 第73页 |
| 2.5.5 PCR产物的酶切及其产物的纯化 | 第73页 |
| 2.5.6 重组质粒pUC18-U-C-D的构建 | 第73-74页 |
| 2.5.7 重组质粒的酶切鉴定 | 第74页 |
| 2.5.8 重组质粒的PCR鉴定 | 第74页 |
| 2.5.9 线性DNA打靶片段的扩增 | 第74页 |
| 2.5.10 鸭源鸡杆菌感受态细胞的制备 | 第74页 |
| 2.5.11 线性DNA打靶片段转化 | 第74页 |
| 2.5.12 鸭源鸡杆菌突变株ΔflfA鉴定 | 第74-75页 |
| 2.5.13 鸭源鸡杆菌突变株ΔflfA生物学特性研究 | 第75页 |
| 3 结果与分析 | 第75-79页 |
| 3.1 扩增出flfA基因上下游同源臂及Cmp抗性基因 | 第75-76页 |
| 3.2 成功构建出质粒pUC18-flfA-U-C-D | 第76页 |
| 3.3 鸭源鸡杆菌突变株AflfA的鉴定 | 第76-77页 |
| 3.3.1 PCR扩增出Cmp抗性基因及flfA基因的两端片段 | 第76-77页 |
| 3.3.2 Western Blotting鉴定出ΔflfA不表达FlfA | 第77页 |
| 3.4 RZ和ΔflfA生长性能及菌落形态相似 | 第77-78页 |
| 3.5 ΔflfA对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力下降 | 第78-79页 |
| 4 讨论与结论 | 第79-80页 |
| 4.1 成功构建了鸭源鸡杆菌flfA缺失突变菌株 | 第79页 |
| 4.2 菌毛在鸭源鸡杆菌黏附鸡原代输卵管上皮细胞中发挥主导作用 | 第79-80页 |
| 全文结论 | 第80-81页 |
| 本研究创新点 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-97页 |
| Abstract | 第97-100页 |
| 附录1:英文缩写词表 | 第101-102页 |
| 附录2:作者简介 | 第102-103页 |
