| 致谢 | 第4-11页 |
| 摘要 | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第12-20页 |
| 1.1 MSTN | 第12-13页 |
| 1.1.1 MSTN基因起源 | 第12页 |
| 1.1.2 MSTN基因结构 | 第12-13页 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 | 第13页 |
| 1.1.4 MSTN基因研究意义 | 第13页 |
| 1.2 CRISPR/Cas | 第13-15页 |
| 1.2.1 基因编辑技术 | 第13页 |
| 1.2.2 CRISPR的研究历史 | 第13-14页 |
| 1.2.3 CRISPR的作用机理 | 第14-15页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas的应用 | 第15页 |
| 1.3 体外受精技术 | 第15-18页 |
| 1.3.1 体外受精技术研究历史 | 第15-16页 |
| 1.3.2 影响体外受精技术的因素 | 第16-18页 |
| 1.3.2.1 精子孵育温度 | 第16页 |
| 1.3.2.2 气相环境 | 第16页 |
| 1.3.2.3 受精液pH值 | 第16页 |
| 1.3.2.4 受精液渗透压 | 第16页 |
| 1.3.2.5 公畜个体差异 | 第16页 |
| 1.3.2.6 精子来源 | 第16-17页 |
| 1.3.2.7 卵母细胞的成熟度 | 第17页 |
| 1.3.2.8 精子洗涤处理 | 第17页 |
| 1.3.2.9 精子密度与精/卵比例 | 第17页 |
| 1.3.2.10 精卵作用时间 | 第17-18页 |
| 1.3.2.11 激活因子的影响 | 第18页 |
| 1.3.2.12 异常受精 | 第18页 |
| 1.3.2.13 多精受精 | 第18页 |
| 1.3.2.14 孤雌发育 | 第18页 |
| 1.3.3 体外受精技术的应用前景 | 第18页 |
| 1.4 显微注射法 | 第18-20页 |
| 1.4.1 影响显微注射对转基因胚胎基因敲除效率的因素 | 第19-20页 |
| 1.4.1.1 外源基因对转基因效率的影响 | 第19页 |
| 1.4.1.2 显微注射时间对转基因效率的影响 | 第19页 |
| 1.4.1.3 显微注射注射位置对转基因效率的影响 | 第19-20页 |
| 2 引言 | 第20-21页 |
| 3 CRISPR/Cas9-MSTN-gRNA的设计及活性验证 | 第21-25页 |
| 3.1 MSTN-gRNA靶向位点的选取 | 第21-22页 |
| 3.2 MSTN-gRNA靶向位点的合成 | 第22页 |
| 3.3 gRNA体外活性检测 | 第22-23页 |
| 3.3.1 实验材料 | 第22页 |
| 3.3.2 实验步骤 | 第22-23页 |
| 3.3.2.1 引物的合成 | 第22页 |
| 3.3.2.2 PCR扩增反应 | 第22-23页 |
| 3.3.2.3 PCR产物的检测 | 第23页 |
| 3.3.2.4 酶切DNA的准备 | 第23页 |
| 3.3.2.5 gRNA的回收与提取 | 第23页 |
| 3.4 Cas9/gRNA体外酶切反应 | 第23-24页 |
| 3.5 Cas9/gRNA体外酶切结果 | 第24-25页 |
| 3.6 讨论 | 第25页 |
| 4 绵羊卵母细胞体外受精及显微注射 | 第25-31页 |
| 4.1 材料和方法 | 第25-27页 |
| 4.1.1 基本材料 | 第25页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第25-26页 |
| 4.1.3 仪器与设备 | 第26-27页 |
| 4.1.4 主要溶液 | 第27页 |
| 4.2 实验步骤 | 第27-29页 |
| 4.2.1 卵巢的清洗 | 第27页 |
| 4.2.2 卵母细胞的采集 | 第27-28页 |
| 4.2.3 卵母细胞的分级 | 第28页 |
| 4.2.4 卵母细胞体外成熟 | 第28页 |
| 4.2.5 卵母细胞成熟的鉴定 | 第28页 |
| 4.2.6 颗粒细胞共培养皿的制备 | 第28页 |
| 4.2.7 精子处理 | 第28-29页 |
| 4.2.8 成熟卵母细胞的体外受精 | 第29页 |
| 4.3 数据分析 | 第29页 |
| 4.4 实验设计 | 第29页 |
| 4.4.1 精子类型对绵羊体外受精效果的影响 | 第29页 |
| 4.4.2 精卵共培养时间对绵羊体外受精效果的影响 | 第29页 |
| 4.5 结果与分析 | 第29-30页 |
| 4.5.1 精子来源对卵母细胞体外受精效果的影响 | 第29页 |
| 4.5.2 精卵共培养时间对卵母细胞体外受精效果的影响 | 第29-30页 |
| 4.6 讨论 | 第30-31页 |
| 4.6.1 精子来源对卵母细胞体外受精效果的影响 | 第30页 |
| 4.6.2 精卵共培养时间对卵母细胞体外受精效果的影响 | 第30-31页 |
| 5 绵羊IVF受精卵mRNAmix显微注射 | 第31-34页 |
| 5.1 材料 | 第31页 |
| 5.2 实验步骤 | 第31-32页 |
| 5.2.1 注射前卵母细胞处理 | 第31页 |
| 5.2.2 显微操作针制作前的玻璃管处理 | 第31页 |
| 5.2.3 拉针 | 第31页 |
| 5.2.4 制作注射针 | 第31页 |
| 5.2.5 持卵针的制作 | 第31页 |
| 5.2.6 操作盘的准备 | 第31页 |
| 5.2.7 受精卵的准备 | 第31-32页 |
| 5.3 胞质显微注射 | 第32页 |
| 5.4 胞质注射后受精卵的体外培养 | 第32页 |
| 5.5 实验设计 | 第32页 |
| 5.5.1 不同时间注射外源RNA对胚胎发育的影响 | 第32页 |
| 5.5.2 注射不同浓度的外源RNA对胚胎发育的影响 | 第32页 |
| 5.6 数据分析 | 第32页 |
| 5.7 结果与分析 | 第32-33页 |
| 5.7.1 不同时间注射外源RNA对胚胎发育的影响 | 第32-33页 |
| 5.7.2 注射不同浓度的外源RNA对胚胎发育的影响 | 第33页 |
| 5.8 讨论 | 第33-34页 |
| 5.8.1 不同时间注射外源RNA对胚胎发育的影响 | 第33页 |
| 5.8.2 注射不同浓度的外源RNA对胚胎发育的影响 | 第33-34页 |
| 6 绵羊胚胎中gRNA-Cas9切割效率验证 | 第34-36页 |
| 6.1 材料和试剂 | 第34页 |
| 6.1.1 实验材料 | 第34页 |
| 6.1.2 实验试剂 | 第34页 |
| 6.1.3 实验仪器 | 第34页 |
| 6.2 实验步骤 | 第34-35页 |
| 6.3 实验结果 | 第35页 |
| 6.4 讨论 | 第35-36页 |
| 7 绵羊胚胎移植、B超检测及接生 | 第36-38页 |
| 7.1 材料和试剂 | 第36页 |
| 7.1.1 实验材料 | 第36页 |
| 7.1.2 实验试剂 | 第36页 |
| 7.1.3 实验器材 | 第36页 |
| 7.2 实验步骤 | 第36-37页 |
| 7.2.1 发情羊的准备 | 第36页 |
| 7.2.2 手术准备 | 第36页 |
| 7.2.3 受体羊的麻醉与绑定 | 第36页 |
| 7.2.4 手术过程 | 第36-37页 |
| 7.3 术后管理 | 第37页 |
| 7.4 B超检测 | 第37页 |
| 7.4.1 母羊保定 | 第37页 |
| 7.4.2 B超探头检查部位和方法 | 第37页 |
| 7.5 接产与助产 | 第37页 |
| 7.6 新生羔羊的护理 | 第37-38页 |
| 8 基因编辑阳性个体的验证 | 第38-41页 |
| 8.1 材料和试剂 | 第38页 |
| 8.1.1 实验材料 | 第38页 |
| 8.1.2 实验试剂 | 第38页 |
| 8.1.3 实验仪器 | 第38页 |
| 8.2 实验步骤 | 第38-39页 |
| 8.3 实验结果 | 第39-40页 |
| 8.3.1 T7E1酶切结果 | 第39页 |
| 8.3.2 测序结果 | 第39-40页 |
| 8.4 讨论 | 第40-41页 |
| 9 结论 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-48页 |
| 附图 | 第48-49页 |
| ABSTRACT | 第49-50页 |
