| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第13-14页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-24页 |
| 1.1 日本乙型脑炎流行病学研究 | 第14-15页 |
| 1.2 日本乙型脑炎病毒的分子生物学 | 第15-17页 |
| 1.3 黄病毒解旋酶的研究进展 | 第17-20页 |
| 1.3.1 登革热病毒(DENV)解旋酶研究进展 | 第18-19页 |
| 1.3.2 丙型肝炎病毒(HCV)解旋酶研究进展 | 第19-20页 |
| 1.3.3 日本乙型脑炎病毒解旋酶的研究进展 | 第20页 |
| 1.4 黄病毒解旋酶抑制剂的研究进展 | 第20-22页 |
| 1.5 JEV的预防与治疗 | 第22-24页 |
| 第2章 研究目的与意义 | 第24-25页 |
| 第3章 材料与方法 | 第25-44页 |
| 3.1 实验材料 | 第25-28页 |
| 3.1.1 毒株与细胞 | 第25页 |
| 3.1.2 菌种与质粒 | 第25页 |
| 3.1.3 引物设计 | 第25页 |
| 3.1.4 荧光底物的设计 | 第25页 |
| 3.1.5 主要药品及试剂 | 第25-26页 |
| 3.1.6 主要培养基及相关溶液 | 第26页 |
| 3.1.7 缓冲液 | 第26-28页 |
| 3.1.7.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液 | 第26-27页 |
| 3.1.7.2 蛋白纯化缓冲液 | 第27页 |
| 3.1.7.3 其他相关缓冲液及抗生素 | 第27-28页 |
| 3.1.8 Western-blot缓冲液的配制 | 第28页 |
| 3.2 实验方法 | 第28-44页 |
| 3.2.1 目的基因的扩增 | 第28页 |
| 3.2.2 NS3-helicase目的片段的回收 | 第28-29页 |
| 3.2.3 表达质粒的构建与鉴定 | 第29-31页 |
| 3.2.3.1 质粒的双酶切与回收 | 第29页 |
| 3.2.3.2 原核表达载体与目的片段的连接与转化 | 第29-30页 |
| 3.2.3.3 重组质粒的提取与酶切鉴定 | 第30-31页 |
| 3.2.3.4 重组表达菌株的构建 | 第31页 |
| 3.2.4 重组菌的表达、鉴定与纯化 | 第31-34页 |
| 3.2.4.1 重组蛋白在EColi中可溶性表达条件的摸索和优化 | 第31-32页 |
| 3.2.4.2 SDS-PAGE检测 | 第32页 |
| 3.2.4.3 Western blot鉴定 | 第32-33页 |
| 3.2.4.4 重组蛋白的表达 | 第33页 |
| 3.2.4.5 可溶性蛋白的纯化及鉴定 | 第33-34页 |
| 3.2.5 BCA法测定蛋白浓度 | 第34-35页 |
| 3.2.6 解旋酶蛋白的ATPase活性测定 | 第35-37页 |
| 3.2.6.1 荧光素酶试剂的ATP检测范围分析 | 第35页 |
| 3.2.6.2 解旋酶蛋白的ATPase活性测定 | 第35页 |
| 3.2.6.3 ATPase反应时间过程 | 第35-36页 |
| 3.2.6.4 二价金属离子及浓度对ATPase活性的影响 | 第36页 |
| 3.2.6.5 单链及双链核酸对ATPase活性的影响 | 第36-37页 |
| 3.2.7 解旋酶蛋白的解旋活性测定 | 第37-39页 |
| 3.2.7.1 解旋反应时间过程分析 | 第37页 |
| 3.2.7.2 解旋反应最佳蛋白和底物浓度的研究 | 第37-38页 |
| 3.2.7.3 解旋反应最佳二价金属离子及浓度的研究 | 第38页 |
| 3.2.7.4 解旋反应最佳ATP浓度的研究 | 第38页 |
| 3.2.7.5 解旋反应最佳温度的研究 | 第38页 |
| 3.2.7.6 解旋反应最佳捕获链浓度的研究 | 第38页 |
| 3.2.7.7 解旋反应最佳反应体系的建立 | 第38页 |
| 3.2.7.8 解旋反应K_m及V_(max)的测定 | 第38-39页 |
| 3.2.8 基于JEV NS3解旋酶结构的抑制剂筛选 | 第39-40页 |
| 3.2.8.1 解旋酶抑制剂的虚拟筛选 | 第39页 |
| 3.2.8.2 DMSO对解旋酶蛋白活性的影响 | 第39-40页 |
| 3.2.8.3 基于解旋酶活性的抑制剂筛选方法的建立 | 第40页 |
| 3.2.9 基于细胞水平的解旋酶抑制剂的抗病毒活性研究 | 第40-44页 |
| 3.2.9.1 Western blot分析化合物的抗病毒活性 | 第40-41页 |
| 3.2.9.2 间接免疫荧光试验 | 第41页 |
| 3.2.9.3 空斑减少试验 | 第41-42页 |
| 3.2.9.4 剂量-效应关系试验 | 第42页 |
| 3.2.9.5 化合物的细胞毒性试验 | 第42-44页 |
| 第4章 结果与分析 | 第44-65页 |
| 4.1 NS3-helicase基因的扩增 | 第44页 |
| 4.2 重组质粒pET30a-helicase的酶切鉴定 | 第44-45页 |
| 4.3 NS3解旋酶原核表达条件的确定 | 第45-46页 |
| 4.4 可溶性解旋酶蛋白的Ni~(2+)-亲和层析纯化 | 第46-47页 |
| 4.5 解旋酶融合蛋白的Western-blot鉴定 | 第47-48页 |
| 4.6 NS3解旋酶ATPase活性检测方法的建立 | 第48-52页 |
| 4.6.1. 荧光素酶化学发光值与ATP浓度的相关性分析 | 第48-49页 |
| 4.6.2 解旋酶蛋白浓度对ATP水解的影响 | 第49页 |
| 4.6.3 ATPase反应的动力学研究 | 第49-50页 |
| 4.6.4 二价金属离子及浓度对ATPase活性的影响 | 第50-51页 |
| 4.6.5 单链及双链核酸对ATPase活性的影响 | 第51-52页 |
| 4.7 解旋酶双链解旋活性的测定 | 第52-57页 |
| 4.7.1 解旋酶反应曲线 | 第52-53页 |
| 4.7.2 解旋反应中酶与底物最佳浓度的确定 | 第53页 |
| 4.7.3 二价离子及浓度对解旋反应的影响 | 第53-54页 |
| 4.7.4 ATP浓度对解旋反应的影响 | 第54-55页 |
| 4.7.5 捕获链对解旋反应的影响 | 第55页 |
| 4.7.6 温度对解旋反应的影响 | 第55-56页 |
| 4.7.7 解旋反应最佳反应体系的建立 | 第56页 |
| 4.7.8 解旋反应K_m及V_(max)的测定 | 第56-57页 |
| 4.8 解旋酶抑制剂筛选方法的建立 | 第57-65页 |
| 4.8.1 DMSO对蛋白解旋活性的影响 | 第57页 |
| 4.8.2 蛋白水平上解旋酶抑制剂的初筛 | 第57-58页 |
| 4.8.3 化合物半数抑制浓度的测定 | 第58页 |
| 4.8.4 化合物在细胞水平的抗病毒活性鉴定 | 第58-65页 |
| 4.8.4.1 化合物抑制JEV的细胞病变效应 | 第58-59页 |
| 4.8.4.2 Western blot | 第59-60页 |
| 4.8.4.3 间接免疫荧光试验 | 第60-62页 |
| 4.8.4.4 空斑减少试验 | 第62-63页 |
| 4.8.4.5 化合物的剂量-效应试验 | 第63页 |
| 4.8.4.6 化合物的细胞毒性试验 | 第63-65页 |
| 第5章 讨论与结论 | 第65-69页 |
| 5.1 讨论 | 第65-68页 |
| 5.1.1 解旋酶在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化 | 第65页 |
| 5.1.2 ATP及捕获链(Capture strand)在解旋反应中发挥重要作用 | 第65-66页 |
| 5.1.3 二价金属离子在ATPase及解旋活性中发挥重要作用 | 第66-67页 |
| 5.1.4 解旋酶抑制剂筛选体系的建立及抑制剂抑制效果的评价 | 第67页 |
| 5.1.5 化合物的抑制机理研究 | 第67-68页 |
| 5.2 结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
