| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| Abbreviations | 第7-12页 |
| 引言 | 第12-14页 |
| 第一部分 TaCDPKs 基因在小麦与叶锈菌互作过程中的表达分析 | 第14-32页 |
| 1 材料与方法 | 第14-19页 |
| 1.1 主要仪器、试剂及试验材料 | 第14-15页 |
| 1.1.1 试验仪器 | 第14页 |
| 1.1.2 供试试剂 | 第14页 |
| 1.1.3 材料 | 第14页 |
| 1.1.4 供试小麦幼苗的培养与接种 | 第14-15页 |
| 1.2 小麦受叶锈菌侵染后 TaCDPKs 基因在 mRNA 水平的表达变化 | 第15-19页 |
| 1.2.1 总 RNA 提取和 cDNA 第一链的合成 | 第15-17页 |
| 1.2.1.1 L10 的培养和取样 | 第15页 |
| 1.2.1.2 总 RNA 提取及纯化 | 第15-16页 |
| 1.2.1.3 总 RNA 浓度、纯度及完整性检测 | 第16页 |
| 1.2.1.4 RNA 反转录成 cDNA | 第16-17页 |
| 1.2.2 PCR 引物设计和实时定量 PCR 反应 | 第17-19页 |
| 1.2.2.1 PCR 引物设计 | 第17页 |
| 1.2.2.2 实时定量 PCR 反应（qRT-PCR） | 第17-19页 |
| 2 结果与分析 | 第19-32页 |
| 2.1 总 RNA 的提取及检测 | 第19-20页 |
| 2.1.1 总 RNA 的浓度及纯度检测 | 第19-20页 |
| 2.1.2 总 RNA 完整性检测 | 第20页 |
| 2.2 内参基因 actin 的实时荧光定量检测 | 第20-22页 |
| 2.2.1 内参基因 actin 的扩增和测序 | 第20-21页 |
| 2.2.2 小麦 actin 基因的标准曲线 | 第21页 |
| 2.2.3 小麦 actin 基因的样品检测 | 第21-22页 |
| 2.3 TaCDPKs 基因的实时荧光定量检测 | 第22-32页 |
| 2.3.1 TaCDPKs 基因的引物扩增效率和特异性 | 第22-24页 |
| 2.3.2 TaCDPKs 基因的实时定量 PCR 分析 | 第24-32页 |
| 第二部分 TaCPK2 互作蛋白的筛选及验证 | 第32-51页 |
| 1 材料与方法 | 第32-44页 |
| 1.1 主要仪器、试剂及试验材料 | 第32-33页 |
| 1.1.1 试验仪器 | 第32页 |
| 1.1.2 供试试剂 | 第32页 |
| 1.1.3 材料 | 第32页 |
| 1.1.4 供试小麦幼苗的培养与接种 | 第32-33页 |
| 1.1.5 试验涉及的培养基 | 第33页 |
| 1.2 TaCPK2 下游互作蛋白的筛选 | 第33-39页 |
| 1.2.1 TaCPK2 基因激酶区 PCR 扩增与序列的获得 | 第33-37页 |
| 1.2.1.1 总 RNA 提取和 cDNA 第一链的合成 | 第33-35页 |
| 1.2.1.2 引物设计 | 第35页 |
| 1.2.1.3 TaCPK2 基因激酶区序列的 PCR 扩增 | 第35页 |
| 1.2.1.4 PCR 产物回收 | 第35-36页 |
| 1.2.1.5 目的片段与 pMD19-T-vector 的连接和转化 | 第36页 |
| 1.2.1.6 CaCl2 法制备大肠杆菌 E.coli DH5α的感受态细胞 | 第36页 |
| 1.2.1.7 连接产物的转化 | 第36页 |
| 1.2.1.8 阳性克隆的蓝白斑筛选 | 第36-37页 |
| 1.2.2 诱饵质粒转化及文库的筛选 | 第37-39页 |
| 1.2.2.1 酵母感受态细胞的制备 | 第37页 |
| 1.2.2.2 诱饵质粒的转化 | 第37页 |
| 1.2.2.3 酵母双杂交 cDNA 文库筛选 | 第37-38页 |
| 1.2.2.4 计算交配效率 | 第38页 |
| 1.2.2.5 PCR 法排除重复的文库质粒 | 第38页 |
| 1.2.2.6 酵母质粒的提取 | 第38-39页 |
| 1.2.2.7 文库质粒的测序和比对 | 第39页 |
| 1.3 酵母双杂交阳性克隆一对一回复验证 | 第39-44页 |
| 1.3.1 TaCPK2 基因激酶区的获得 | 第39页 |
| 1.3.2 TasHSP 基因全长 cds 的获得 | 第39-41页 |
| 1.3.2.1 总 RNA 提取和 cDNA 第一链的合成 | 第39页 |
| 1.3.2.2 引物设计 | 第39页 |
| 1.3.2.3 TasHSP 基因全长 cds 序列的 PCR 扩增 | 第39-40页 |
| 1.2.2.4 PCR 产物回收 | 第40页 |
| 1.2.2.5 目的片段与 pMD19-T-vector 的连接和转化 | 第40页 |
| 1.2.2.6 CaCl2 法制备大肠杆菌 E.coli DH5α的感受态细胞 | 第40-41页 |
| 1.2.2.7 连接产物的转化 | 第41页 |
| 1.2.2.8 阳性克隆的蓝白斑筛选 | 第41页 |
| 1.3.3 互作载体构建 | 第41-44页 |
| 1.3.3.1 载体质粒 | 第41页 |
| 1.3.3.2 重组载体构建 | 第41-42页 |
| 1.3.3.3 重组载体的鉴定 | 第42页 |
| 1.3.3.4 酵母感受态细胞的制备 | 第42-43页 |
| 1.3.3.5 酵母质粒的共转化 | 第43页 |
| 1.3.3.6 共转化酵母的稀释涂布 | 第43-44页 |
| 2 结果与分析 | 第44-51页 |
| 2.1 TaCPK2 酵母双杂交诱饵质粒的构建、鉴定 | 第44-45页 |
| 2.1.1 TaCPK2 激酶区基因目的片段的获得 | 第44-45页 |
| 2.1.3 酵母转化及自激活鉴定 | 第45页 |
| 2.1.4 毒性鉴定 | 第45页 |
| 2.2 受叶锈菌侵染的小麦叶片酵母双杂交 cDNA 文库的筛选 | 第45-49页 |
| 2.2.1 文库的初步筛选 | 第45-47页 |
| 2.2.2 对阳性克隆的二次筛选 | 第47-48页 |
| 2.2.3 阳性克隆序列分析 | 第48-49页 |
| 2.3 酵母一对一回复验证质粒的构建、鉴定 | 第49-50页 |
| 2.3.1 TasHSP 全长和 TaCPK2 激酶区基因目的片段的获得 | 第49页 |
| 2.3.2 蛋白互作重组载体的构建 | 第49-50页 |
| 2.4 酵母双杂交阳性克隆的一对一回复验证 | 第50-51页 |
| 讨论 | 第51-54页 |
| 1、探究 TaCDPKs 家族在小麦与叶锈菌互作过程中的作用 | 第51页 |
| 2、TaCDPKs 的表达分析及在小麦抵抗病原物入侵的防卫反应中的作用的探讨 | 第51-52页 |
| 3、TaCPK2 的研究对整个 TaCDPK 家族的影响 | 第52页 |
| 4、影响实时定量 PCR 的关键因素的思考 | 第52-53页 |
| 5、HSP 基因在小麦与叶锈菌互作过程中的作用及意义 | 第53页 |
| 6、TaCPK2 与所筛选得到的下游靶蛋白之间互作的进一步验证 | 第53-54页 |
| 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-59页 |
| 作者简历 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
