| 中文摘要 | 第8-12页 |
| ABSTRACT | 第12-16页 |
| 缩略符号说明(ABBREVIATION) | 第17-19页 |
| 第一章 绪论 | 第19-33页 |
| 1.1 木质纤维素的结构与成分 | 第19-20页 |
| 1.2 木质纤维素生物炼制工艺 | 第20-22页 |
| 1.3 木质纤维素水解液中的抑制物及其来源 | 第22页 |
| 1.4 木质纤维素水解液中抑制物的抑制机理 | 第22-25页 |
| 1.4.1 酚类抑制物的抑制机理 | 第23-24页 |
| 1.4.2 呋喃醛类抑制物的抑制机理 | 第24-25页 |
| 1.4.3 有机弱酸类抑制物的抑制机理 | 第25页 |
| 1.4.4 香草醛、糠醛和HMF抑制机理的共同特点 | 第25页 |
| 1.5 应对木质纤维素水解液中抑制物的策略 | 第25-31页 |
| 1.5.1 发酵前脱毒 | 第25-26页 |
| 1.5.2 发酵过程控制减少抑制物影响 | 第26-27页 |
| 1.5.3 高耐受性酿酒酵母菌株的选育 | 第27-31页 |
| 1.5.3.1 诱变育种 | 第27页 |
| 1.5.3.2 进化工程策略 | 第27-28页 |
| 1.5.3.3 基因工程改造策略 | 第28-31页 |
| 1.6 本论文的研究意义以及主要内容 | 第31-33页 |
| 第二章 介导香草醛高耐受性氧化还原酶的鉴定与机制研究 | 第33-59页 |
| 2.1 导言 | 第33-34页 |
| 2.2 材料与方法 | 第34-44页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第34-36页 |
| 2.2.2 酶和试剂 | 第36页 |
| 2.2.3 培养基 | 第36-37页 |
| 2.2.4 仪器与设备 | 第37-38页 |
| 2.2.5 微生物学技术 | 第38页 |
| 2.2.5.1 菌株培养 | 第38页 |
| 2.2.5.2 菌种保存 | 第38页 |
| 2.2.6 分子生物学方法 | 第38-41页 |
| 2.2.6.1 目的片段的PCR扩增及测序 | 第38页 |
| 2.2.6.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第38-39页 |
| 2.2.6.3 DNA浓度测定 | 第39页 |
| 2.2.6.4 DNA片段的回收与纯化 | 第39页 |
| 2.2.6.5 PCR产物与载体的酶切 | 第39页 |
| 2.2.6.6 质粒的构建及大肠杆菌转化 | 第39页 |
| 2.2.6.7 大肠杆菌质粒提取 | 第39-40页 |
| 2.2.6.8 酵母完整细胞转化法 | 第40页 |
| 2.2.6.9 酿酒酵母基因组提取 | 第40页 |
| 2.2.6.10 酿酒酵母质粒提取 | 第40页 |
| 2.2.6.11 基因敲除 | 第40-41页 |
| 2.2.7 粗酶液提取及酶活测定 | 第41页 |
| 2.2.8 蛋白浓度测定 | 第41页 |
| 2.2.9 细胞内还原型辅酶/氧化型辅酶测定 | 第41-42页 |
| 2.2.10 RNA-Seq | 第42-43页 |
| 2.2.11 酿酒酵母总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR | 第43页 |
| 2.2.12 发酵及生长曲线测定 | 第43页 |
| 2.2.13 发酵产物分析 | 第43-44页 |
| 2.2.14 代谢参数计算 | 第44页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第44-57页 |
| 2.3.1 RNA-Seq分析介导香草醛高耐受性的可能氧化还原酶基因 | 第44-46页 |
| 2.3.2 酿酒酵母中存在除Adh6p和Adh7p之外的能够催化香草醛还原的内源性氧化还原酶 | 第46-50页 |
| 2.3.2.1 超表达ADH6菌株和ADH6缺失菌株的构建 | 第46-49页 |
| 2.3.2.2 重组菌株CEN.PK102-3A(ADH6)及CEN.PK102-3A(adh6△)在香草醛抑制条件下的发酵情况 | 第49-50页 |
| 2.3.3 在香草醛高耐受菌株中高水平表达的氧化还原酶和酿酒酵母香草醛耐受相关性的研究 | 第50-55页 |
| 2.3.3.1 超表达氧化还原酶重组菌株的构建 | 第51页 |
| 2.3.3.2 超表达氧化还原酶的重组菌株在香草醛胁迫下的发酵情况 | 第51-55页 |
| 2.3.4 超表达氧化还原酶对酿酒酵母粗酶液以香草醛为底物的还原酶酶活的影响 | 第55-56页 |
| 2.3.5 超表达氧化还原酶对酿酒酵母细胞质内辅酶的影响 | 第56-57页 |
| 2.4 本章小结 | 第57-59页 |
| 第三章 香草醛高耐受性菌株的基因组突变研究 | 第59-79页 |
| 3.1 导言 | 第59页 |
| 3.2 材料与方法 | 第59-63页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第59-61页 |
| 3.2.2 酶和试剂 | 第61页 |
| 3.2.3 培养基 | 第61页 |
| 3.2.4 仪器与设备 | 第61页 |
| 3.2.5 微生物学技术 | 第61页 |
| 3.2.5.1 梯度生长实验 | 第61页 |
| 3.2.6 分子生物学方法 | 第61-62页 |
| 3.2.6.1 基因敲除 | 第62页 |
| 3.2.7 蛋白浓度测定 | 第62页 |
| 3.2.8 发酵及生长曲线测定 | 第62-63页 |
| 3.2.9 发酵产物分析 | 第63页 |
| 3.2.10 代谢参数计算 | 第63页 |
| 3.2.11 基因组测序 | 第63页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第63-76页 |
| 3.3.1 野生型NAN-27的de novo测序和驯化菌株的基因组重测序 | 第63-66页 |
| 3.3.2 突变位点的聚类分析及PCR验证 | 第66-67页 |
| 3.3.3 InDel突变基因对香草醛耐受性影响的研究 | 第67-70页 |
| 3.3.3.1 各个基因缺失菌株的构建: | 第68-70页 |
| 3.3.3.2 敲除InDel突变基因对菌株香草醛耐受性影响 | 第70页 |
| 3.3.4 香草醛胁迫下YRR1的缺失对菌株生理代谢的影响 | 第70-73页 |
| 3.3.5 回补YRR1降低菌株香草醛耐受性 | 第73-75页 |
| 3.3.5.1 YRR1回补菌株的构建 | 第73-74页 |
| 3.3.5.2 YRR1回补菌株的香草醛耐受性情况 | 第74-75页 |
| 3.3.6 YRR1缺失对酿酒酵母香草醛耐受性的提高具有一定普适性 | 第75-76页 |
| 3.4 本章小结 | 第76-79页 |
| 第四章 转录因子基因YRR1缺失提高香草醛耐受性机制的研究 | 第79-105页 |
| 4.1 导言 | 第79页 |
| 4.2 材料与方法 | 第79-83页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第79-81页 |
| 4.2.2 酶和试剂 | 第81页 |
| 4.2.3 培养基 | 第81页 |
| 4.2.4 仪器与设备 | 第81页 |
| 4.2.5 微生物学技术 | 第81-82页 |
| 4.2.6 分子生物学方法 | 第82页 |
| 4.2.7 发酵及生长曲线测定 | 第82页 |
| 4.2.8 发酵产物分析 | 第82页 |
| 4.2.9 代谢参数计算 | 第82页 |
| 4.2.10 转录组学测序RNA-Seq | 第82-83页 |
| 4.2.11 酿酒酵母总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR | 第83页 |
| 4.2.12 粗酶液提取及酶活测定 | 第83页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第83-102页 |
| 4.3.1 菌株的构建 | 第83-86页 |
| 4.3.2 YRR1缺失引起菌株转录组变化的研究 | 第86-94页 |
| 4.3.3 YRR1缺失提高菌株香草醛耐受性的机制研究 | 第94-102页 |
| 4.3.3.1 YRR1缺失提高脱氢酶基因ADH7表达水平从而提高菌株香草醛耐受性 | 第94-95页 |
| 4.3.3.2 YRR1缺失引起的酯外排蛋白基因PRY1转录水平下调不影响菌株香草醛耐受性 | 第95-96页 |
| 4.3.3.3 YRR1缺失引起的葡萄糖转运蛋白基因HXT2表达水平上调不影响菌株香草醛耐受性 | 第96-97页 |
| 4.3.3.4 YRR1缺失提高多药性转运蛋白表达水平从而提高菌株香草醛耐受性 | 第97-99页 |
| 4.3.3.5 YRR1缺失增强核糖体合成和rRNA加工过程从而提高菌株香草醛耐受性 | 第99-102页 |
| 4.4 本章小结 | 第102-105页 |
| 全文总结及展望 | 第105-111页 |
| 附录一 | 第111-121页 |
| 参考文献 | 第121-135页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第135-137页 |
| 致谢 | 第137-138页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第138页 |
