| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-19页 |
| 1.1 引言 | 第11页 |
| 1.2 非编码RNA | 第11-12页 |
| 1.3 小RNA (small RNA) | 第12页 |
| 1.4 大肠杆菌中的sRNA GlmZ | 第12-14页 |
| 1.5 SHAPE | 第14-17页 |
| 1.6 大肠杆菌DEAD-box RNA解旋酶CsdA | 第17-19页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第19-42页 |
| 2.1 基因克隆 | 第19-23页 |
| 2.1.1 RapZ全长边界的选择及引物设计 | 第19页 |
| 2.1.2 PCR扩增程序 | 第19-20页 |
| 2.1.3 PCR产物鉴定、回收 | 第20页 |
| 2.1.4 凝胶分离回收目的DNA片段 | 第20-21页 |
| 2.1.5 质粒抽提 | 第21页 |
| 2.1.6 质粒载体和目的片段双酶切 | 第21-22页 |
| 2.1.7 连接 | 第22页 |
| 2.1.8 连接产物转化到BL21 DE3感受态细胞 | 第22页 |
| 2.1.9 保种送测序 | 第22-23页 |
| 2.1.10 BL21 DE3感受态细胞的制备 | 第23页 |
| 2.2 蛋白表达纯化 | 第23-26页 |
| 2.2.1 目的蛋白表达 | 第23-24页 |
| 2.2.2 大肠杆菌细胞收集、破碎 | 第24页 |
| 2.2.3 Ni-NTA亲和纯化 | 第24页 |
| 2.2.4 酶切目的蛋白上的His标签 | 第24-25页 |
| 2.2.5 SDS-PAGE蛋白质电泳 | 第25页 |
| 2.2.6 凝胶过滤层析 | 第25-26页 |
| 2.3 RNA体外转录及纯化 | 第26-31页 |
| 2.3.1 RNA转录模版设计 | 第26页 |
| 2.3.2 Yeast tRNA~(asp)转录模版—引物PCR法 | 第26-27页 |
| 2.3.3 RNA转录体系 | 第27-28页 |
| 2.3.4 转录产物的预处理及纯化 | 第28-31页 |
| 2.3.4.1 变性纯化 | 第28-30页 |
| 2.3.4.2 非变性纯化 | 第30-31页 |
| 2.4 SHAPE实验 | 第31-35页 |
| 2.4.1 SHAPE实验原理 | 第31-32页 |
| 2.4.2 RNA模版构建 | 第32页 |
| 2.4.3 RNA折叠复性 | 第32-33页 |
| 2.4.4 RNA修饰 | 第33页 |
| 2.4.5 RNA沉淀 | 第33页 |
| 2.4.6 RNA逆转录引物延伸与RNA sequencing | 第33-34页 |
| 2.4.7 测序和变性胶鉴定 | 第34-35页 |
| 2.5 核酸和蛋白质的相互作用实验 | 第35-37页 |
| 2.5.1 凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA) | 第35页 |
| 2.5.2 荧光偏振实验(Fluorescence Polarization,FP) | 第35-37页 |
| 2.6 CsdA的ATPase活性实验 | 第37-38页 |
| 2.6.1 CsdA的ATPase活性的测定原理 | 第37页 |
| 2.6.2 CsdA的ATPase活性的测定的步骤 | 第37-38页 |
| 2.7 解旋酶活性实验 | 第38-39页 |
| 2.8 硒代甲硫氨酸RapZ蛋白质的表达 | 第39-40页 |
| 2.9 蛋白单体以及复合物晶体生长 | 第40-42页 |
| 2.9.1 RapZ蛋白质晶体生长 | 第40-41页 |
| 2.9.2 向RapZ蛋白质的native晶体引入重金属 | 第41页 |
| 2.9.3 CsdA_RBD与23sRNA_H92_15ss RNA的复合物晶体生长 | 第41-42页 |
| 第三章 RapZ和GlmZ结构与功能的研究 | 第42-57页 |
| 3.1 RapZ蛋白质序列比对 | 第42-43页 |
| 3.2 RapZ蛋白质的表达 | 第43页 |
| 3.3 RapZ晶体的获取和衍射 | 第43-45页 |
| 3.4 GlmZ的转录纯化 | 第45页 |
| 3.5 GlmZ SL2和RapZ的相互作用实验 | 第45-46页 |
| 3.6 SHAPE实验 | 第46-53页 |
| 3.6.1 tRNA转录以及复性 | 第47-48页 |
| 3.6.2 tRNA~(asp)的SHAPE实验结果 | 第48-49页 |
| 3.6.3 SHAPE数据处理 | 第49-53页 |
| 3.7 Rox2 R2H1的SHAPE结果 | 第53-56页 |
| 3.8 小结与讨论 | 第56-57页 |
| 第四章 CsdA和RNA结构与功能的研究 | 第57-65页 |
| 4.1 大肠杆菌CsdA的各个结构域的表达纯化 | 第57页 |
| 4.2 CsdA 445和CsdA 564的ATPase活性测定 | 第57-59页 |
| 4.3 CsdA异二聚体解旋酶活性研究 | 第59-62页 |
| 4.3.1 CsdA 445和CsdA 564交换实验 | 第59-60页 |
| 4.3.2 解旋实验 | 第60-62页 |
| 4.4 CsdA各个结构域对RNA的亲和力研究 | 第62-63页 |
| 4.5 CsdA RBD与RNA的复合物晶体生长 | 第63-64页 |
| 4.6 小结与展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-69页 |
| 致谢 | 第69-71页 |
| 在读期间发表的学术论文与参加的学术会议 | 第71页 |
