| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一章 文章综述 | 第11-19页 |
| 1.1 鸭疫里默氏杆菌病原特征 | 第11页 |
| 1.2 鸭疫里默氏杆菌流行病学 | 第11-12页 |
| 1.3 鸭疫里默氏杆菌的致病因子与毒力因子 | 第12-14页 |
| 1.3.1 LPS | 第12-13页 |
| 1.3.2 外膜蛋白 | 第13页 |
| 1.3.3 荚膜多糖 | 第13-14页 |
| 1.4 烟酰胺酶研究进展 | 第14-19页 |
| 1.4.1 NAMase的发现及分布 | 第14页 |
| 1.4.2 NAMase保守残基的的研究 | 第14-16页 |
| 1.4.3 NAMase的生物学功能研究 | 第16-19页 |
| 第二章 鸭疫里默氏杆菌NAMase蛋白生物信息学分析 | 第19-27页 |
| 2.1 材料来源 | 第19页 |
| 2.2 生物信息学预测蛋白质结构、功能 | 第19-20页 |
| 2.2.1 意义 | 第19页 |
| 2.2.2 方法 | 第19-20页 |
| 2.2.3 步骤 | 第20页 |
| 2.3 结果与分析 | 第20-26页 |
| 2.3.1 氨基酸理化参数分析 | 第20-21页 |
| 2.3.2 蛋白质信号肽预测 | 第21-22页 |
| 2.3.3 蛋白跨膜区预测 | 第22-23页 |
| 2.3.4 蛋白亲疏水性分析 | 第23页 |
| 2.3.5 蛋白B细胞表位分析 | 第23-24页 |
| 2.3.6 蛋白亚细胞定位 | 第24页 |
| 2.3.7 蛋白质二级结构 | 第24-25页 |
| 2.3.8 蛋白质的三级结构 | 第25-26页 |
| 2.4 讨论 | 第26-27页 |
| 第三章 鸭疫里默氏杆菌NAMase原核表达及NAMase亚细胞定位 | 第27-47页 |
| 3.1 实验材料 | 第27-30页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第27页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第27页 |
| 3.1.3 工具酶及分子量参照标准 | 第27页 |
| 3.1.4 试剂盒 | 第27页 |
| 3.1.5 主要溶液配制 | 第27-29页 |
| 3.1.6 主要培养基配制 | 第29-30页 |
| 3.1.7 主要实验仪器 | 第30页 |
| 3.2 NAMase基因分布检测 | 第30-32页 |
| 3.2.1 鸭疫里默氏杆菌基因组提取 | 第30-31页 |
| 3.2.2 引物设计 | 第31页 |
| 3.2.3 不同鸭疫里默氏杆菌菌株NAMase基因分布情况检测 | 第31-32页 |
| 3.3 重组质粒pET28a-NAMase的构建 | 第32-35页 |
| 3.3.1 NAMase编码基因的扩增及回收 | 第32页 |
| 3.3.2 质粒pET28a的提取 | 第32-33页 |
| 3.3.3 PCR产物与pET28a载体双酶切 | 第33-34页 |
| 3.3.4 连接反应 | 第34页 |
| 3.3.5 构建DH5α-pET28a-NAMase | 第34页 |
| 3.3.6 重组质粒的鉴定 | 第34-35页 |
| 3.3.7 构建表达菌株BL21-pET28a-NAMase | 第35页 |
| 3.4 诱导表达 | 第35-36页 |
| 3.4.1 NAMase重组蛋白表达 | 第35页 |
| 3.4.2 SDS-PAGE分析重组质粒表达产物的可溶性 | 第35-36页 |
| 3.5 NAMase重组蛋白纯化 | 第36-37页 |
| 3.5.1 pET28a-NAMase表达菌的纯化 | 第36-37页 |
| 3.5.2 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化 | 第37页 |
| 3.5.3 BCA法测定蛋白浓度 | 第37页 |
| 3.6 NAMase多克隆抗体的制备与检测 | 第37-39页 |
| 3.6.1 NAMase多克隆抗体的制备 | 第37-38页 |
| 3.6.2 抗体效价检测 | 第38页 |
| 3.6.3 表达产物的Western blot检测 | 第38-39页 |
| 3.7 NAMase亚细胞定位 | 第39-40页 |
| 3.7.1 鸭疫里默氏杆菌Yb2全菌蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白的提取 | 第39页 |
| 3.7.2 RA-Yb2-NAMase亚细胞定位 | 第39-40页 |
| 3.8 结果 | 第40-46页 |
| 3.8.1 NAMase基因分布检测结果 | 第40页 |
| 3.8.2 鸭疫里默氏杆菌Yb2 NAMase基因片段的PCR扩增和鉴定 | 第40-41页 |
| 3.8.3 pET28a-NAMase重组原核表达质粒的鉴定 | 第41-42页 |
| 3.8.4 重组质粒的表达及表达产物的可溶性分析 | 第42-43页 |
| 3.8.5 重组质粒表达产物的纯化 | 第43-44页 |
| 3.8.6 多克隆抗体效价检测 | 第44-45页 |
| 3.8.7 重组蛋白的Western blot检测 | 第45页 |
| 3.8.8 RA-Yb2-NAMase亚细胞定位 | 第45-46页 |
| 3.9 小结 | 第46-47页 |
| 第四章 RA-Yb2-NAMase酶活性的测定 | 第47-51页 |
| 4.1 实验材料 | 第47页 |
| 4.1.1 实验仪器 | 第47页 |
| 4.1.2 菌株 | 第47页 |
| 4.1.3 主要化学试剂 | 第47页 |
| 4.2 烟酰胺酶酶学活性测定 | 第47-49页 |
| 4.2.1 酶活测定原理 | 第47页 |
| 4.2.2 酶活测定方法 | 第47-48页 |
| 4.2.3 最适pH测定 | 第48页 |
| 4.2.4 最适温度测定 | 第48页 |
| 4.2.5 不同金属离子对酶活力的影响 | 第48-49页 |
| 4.3 结果 | 第49-51页 |
| 4.3.1 最适pH值结果 | 第49页 |
| 4.3.2 最适温度结果 | 第49页 |
| 4.3.3 不同金属离子对酶活力的影响的结果 | 第49-51页 |
| 全文总结 | 第51-53页 |
| 参考文献 | 第53-57页 |
| 附录 | 第57-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
