| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-14页 |
| 1 文献综述 | 第14-36页 |
| ·伪狂犬病的流行病学 | 第14-15页 |
| ·伪狂犬病毒(PRV)的分子生物学 | 第15-31页 |
| ·病毒粒子结构 | 第15-16页 |
| ·病毒基因组 | 第16-18页 |
| ·病毒主要蛋白 | 第18-24页 |
| ·病毒的复制周期 | 第24-27页 |
| ·立即早期基因IE180 | 第27-28页 |
| ·早期基因EP0 | 第28-30页 |
| ·TK基因和UL54基因 | 第30-31页 |
| ·伪狂犬病毒的神经嗜性和潜伏感染 | 第31-32页 |
| ·伪狂犬病毒的神经嗜性 | 第31-32页 |
| ·伪狂犬病毒的潜伏感染 | 第32页 |
| ·RNAi技术 | 第32-36页 |
| 2 研究目的与意义 | 第36-37页 |
| 3 材料与方法 | 第37-50页 |
| ·实验材料 | 第37-44页 |
| ·毒株、细胞、实验动物和多克隆抗体 | 第37页 |
| ·菌种与质粒 | 第37页 |
| ·工具酶及相关试剂 | 第37-41页 |
| ·主要培养基及其配制 | 第41-42页 |
| ·主要缓冲液及其配制 | 第42-44页 |
| ·主要仪器设备 | 第44页 |
| ·实验方法 | 第44-50页 |
| ·细胞培养和病毒增殖 | 第44页 |
| ·细胞转染实验 | 第44-45页 |
| ·PRV基因组模板的制备 | 第45页 |
| ·DNA片段的回收与纯化 | 第45页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备与转化(氯化钙法) | 第45页 |
| ·连接产物或质粒的转化 | 第45页 |
| ·质粒的小量制备(碱裂解法) | 第45-46页 |
| ·质粒的大量制备(碱裂解法) | 第46页 |
| ·蛋白质诱导表达 | 第46-47页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第47页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第47页 |
| ·抗体的制备 | 第47-48页 |
| ·Western blot检测 | 第48页 |
| ·流式细胞仪分析 | 第48页 |
| ·β-半乳糖苷酶在真核细胞表达的检测 | 第48-50页 |
| 4 结果与分析 | 第50-96页 |
| ·IE180基因特异性siRNA分子的设计、合成及筛选 | 第50-57页 |
| ·IE180与EGFP基因融合表达载体的构建 | 第50-51页 |
| ·IE180基因的分段克隆、表达及抗体制备 | 第51-53页 |
| ·IE180基因的部分序列测定 | 第53-55页 |
| ·siRNA分子的设计与合成 | 第55-56页 |
| ·siRNA分子表达载体的构建及测序验证 | 第56页 |
| ·细胞共转染及siRNA分子的筛选 | 第56-57页 |
| ·报告基因真核表达载体的构建 | 第57-60页 |
| ·EGFP报告基因载体的构建 | 第57-58页 |
| ·lacZ报告基因载体的构建 | 第58-60页 |
| ·PRV Ea株IE180基因启动子的克隆与功能验证 | 第60-63页 |
| ·PRV Ea株IE180基因启动子的克隆与序列测定 | 第60-62页 |
| ·IE180基因启动子的功能验证 | 第62-63页 |
| ·PRV Ea株EP0基因启动子的克隆与功能验证 | 第63-66页 |
| ·PRV Ea株EP0基因启动子克隆与序列测定 | 第63-65页 |
| ·EP0基因启动子的功能验证 | 第65-66页 |
| ·PRV Ea株TK基因启动子的克隆与功能验证 | 第66-69页 |
| ·PRV Ea株TK基因启动子克隆与序列测定 | 第66-68页 |
| ·TK基因启动子的功能验证 | 第68-69页 |
| ·PRV Ea株和Fa株EP0基因及其突变体的真核表达载体的构建 | 第69-77页 |
| ·PRV Fa株EP0基因的克隆与序列分析 | 第69-70页 |
| ·真核表达载体pcEP0/Ea、pcEP0/Fa的构建 | 第70-71页 |
| ·EP0基因同源性比较 | 第71-72页 |
| ·不同毒株EP0疏水性比较分析 | 第72-75页 |
| ·真核表达载体pcEP0mut/Ea、pcEP0mut/Fa的构建 | 第75-77页 |
| ·Western-blot检测EP0/Ea、EP0/Fa、mutEP0/Ea与mutEP0/Fa在细胞中的表达 | 第77页 |
| ·PRV Ea株IE180、EP0和Fa株EP0对IE180、EP0和TK基因启动子的调控分析 | 第77-81页 |
| ·IE180基因真核表达载体的构建 | 第77-78页 |
| ·PRV Ea株IE180、EP0、TK基因启动子活性比较 | 第78-79页 |
| ·IE180/Ea、EP0/Ea和EP0/Fa对IE180、EP0和TK基因启动子的调控分析 | 第79-81页 |
| ·EP0/Ea、mutEP0/Ea、EP0/Fa及mutEP0/Fa对PRV Ea株IE180基因启动子的调控分析 | 第81-85页 |
| ·pIE-EGFP与EP0不同表达载体的共转染及流式细胞仪分析 | 第82页 |
| ·pIE-LacZ与EP0表达载体的共转染及β-gal表达检测 | 第82-85页 |
| ·EP0/Ea、mutEP0/Ea、EP0/Fa及mutEP0/Fa对PRV Ea株TK基因启动子的调控分析 | 第85-88页 |
| ·pTK-EGFP与EP0表达载体的共转染及流式细胞仪分析 | 第85页 |
| ·pTK-LacZ与EP0表达载体的共转染及β-gal表达检测 | 第85-88页 |
| ·PRV Ea株和Fa株EP0基因的功能域分析 | 第88-96页 |
| ·不同截短形式的EP0/Ea缺失突变体的真核表达载体的构建 | 第89-91页 |
| ·不同截短形式的EP0/Fa缺失突变体的真核表达载体的构建 | 第91-93页 |
| ·pIE-EGFP和pTK-EGFP与EP0/Ea不同缺失突变体真核表达质粒的共转染及流式细胞仪分析 | 第93-94页 |
| ·pIE-EGFP和pTK-EGFP与EP0/Fa不同缺失突变体真核表达质粒的共转染及流式细胞仪分析 | 第94-96页 |
| 5 讨论与结论 | 第96-104页 |
| ·讨论 | 第96-102页 |
| ·PRV Ea株IE180、EP0、TK三个基因启动子的克隆 | 第96-97页 |
| ·IE180基因对EP0和TK基因的转录激活 | 第97-98页 |
| ·IE180基因和EP0基因的自调控 | 第98页 |
| ·EP0/Ea和EP0/Fa对IE180、TK基因的负调控 | 第98-99页 |
| ·PRV不同毒株EP0的比较分析 | 第99-100页 |
| ·EP0/Ea、EP0/Fa的第85和第86位氨基酸的变化对其调控功能的影响 | 第100-101页 |
| ·PRV Ea株和Fa株EP0基因的功能域分析 | 第101页 |
| ·PRV IE180基因特异性siRNA分子的筛选 | 第101-102页 |
| ·结论 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 附录 | 第117页 |
