| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-36页 |
| ·化学农药污染对环境和人类健康的严重危害及严峻形势概况 | 第15-17页 |
| ·生物杀虫剂研制的概况及杆状病毒杀虫剂研究现状和存在的问题 | 第17-29页 |
| ·生物杀虫剂研制的概况 | 第17-18页 |
| ·杆状病毒杀虫剂研究现状和存在的问题 | 第18-29页 |
| ·昆虫杆状病毒研究基本情况 | 第18-23页 |
| ·杆状病毒的基本特性 | 第18页 |
| ·杆状病毒对宿主幼虫的感染 | 第18页 |
| ·杆状病毒在昆虫幼虫的侵染历程与复制 | 第18-21页 |
| ·杆状病毒基因组学研究进展 | 第21-23页 |
| ·重组昆虫杆状病毒杀虫剂研究进展 | 第23-28页 |
| ·插入外源基因,提高杀虫速度 | 第24-26页 |
| ·缺失病毒非必需基因,增加杀虫效果 | 第26页 |
| ·修饰病毒本身基因扩大寄主域 | 第26-28页 |
| ·其它方法 | 第28页 |
| ·我国重组昆虫杆状病毒杀虫剂研究现状 | 第28-29页 |
| ·蜘蛛毒素研究现状及Hv2a基因的作为生物杀虫剂的特点、优点 | 第29-31页 |
| ·昆虫特异杂合表达载体高效快速表达的特点与优点 | 第31-34页 |
| ·杆状病毒表达载体系统的基本原理 | 第32页 |
| ·杆状病毒表达载体系统的优点 | 第32-34页 |
| ·表达外源基因的高效性 | 第32-33页 |
| ·表达产物具有生物活性 | 第33页 |
| ·适合表达细胞毒性蛋白 | 第33页 |
| ·高容量性 | 第33页 |
| ·安全性高 | 第33-34页 |
| ·杆状病毒表达载体系统的缺点 | 第34页 |
| ·瞬时表达 | 第34页 |
| ·糖基化简单 | 第34页 |
| ·影响目的基因表达的因素 | 第34页 |
| ·本课题研究的背景和目的 | 第34-35页 |
| ·本课题研究的主要内容 | 第35-36页 |
| 第二章 高效快速表达外源基因模型的建立 | 第36-59页 |
| ·材料与方法 | 第37-51页 |
| ·材料 | 第37-38页 |
| ·载体 | 第37页 |
| ·昆虫细胞与培养基 | 第37页 |
| ·AcNPV线性DNA与转染缓冲液 | 第37页 |
| ·工具酶与试剂 | 第37页 |
| ·宿主菌与细菌培养基 | 第37-38页 |
| ·缓冲液与溶液 | 第38页 |
| ·方法 | 第38-51页 |
| ·BP-Lu克隆载体的构建 | 第38-42页 |
| ·PCR扩增Luciferase基因的引物设计 | 第38页 |
| ·PCR扩增Luciferase基因 | 第38-39页 |
| ·PCR产物/酶切目的片段的回收 | 第39-40页 |
| ·Klenow片段补平 | 第40页 |
| ·补平的Klenow片段与克隆载体Blunt-PCR~(TM)连接 | 第40页 |
| ·宿主菌E.coli DH5a感受态细胞的制备 | 第40页 |
| ·连接产物转化宿主菌DH5α/E.coli XL-2-Blue菌株的感受态细胞 | 第40-41页 |
| ·质粒的提取 | 第41-42页 |
| ·酶切鉴定 | 第42页 |
| ·测序 | 第42页 |
| ·pAcE1-Lu转移载体的构建 | 第42-45页 |
| ·转移载体pAcE1的制备 | 第42-44页 |
| ·pAcE1载体EcoRI-BamHI大片段的制备 | 第43页 |
| ·pAcE1载体XhoI-BamHI poly A片段的制备 | 第43-44页 |
| ·荧光蛋白指示基因(Lu)片段的制备 | 第44页 |
| ·pAcEl-Lu转移载体的构建 | 第44页 |
| ·连接产物转化宿主菌DH5α菌株的感受态细胞 | 第44页 |
| ·质粒DNA提取 | 第44-45页 |
| ·酶切鉴定 | 第45页 |
| ·pVL1392—Lu转移载体的构建 | 第45-47页 |
| ·pVL1392 DNA转移载体线性化 | 第46页 |
| ·荧光蛋白指示基因(Lu)片段的制备 | 第46-47页 |
| ·pVL1392-Lu转移载体的构建 | 第47页 |
| ·连接产物转化宿主菌DH5α菌株的感受态细胞 | 第47页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第47页 |
| ·酶切鉴定 | 第47页 |
| ·昆虫细胞培养的复苏、传代及冷冻保存 | 第47-48页 |
| ·冻存昆虫细胞的复苏 | 第47-48页 |
| ·昆虫细胞传代培养 | 第48页 |
| ·冷冻保存 | 第48页 |
| ·转染和共转染 | 第48-49页 |
| ·病毒的繁殖 | 第49页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第49-50页 |
| ·表达活性测定 | 第50-51页 |
| ·细胞抽提物的制备 | 第50-51页 |
| ·荧光素酶分析 | 第51页 |
| ·结果分析 | 第51-56页 |
| ·Luciferace基因的克隆 | 第51页 |
| ·pAcEl-Lu转移载体的构建 | 第51-54页 |
| ·pVL1392-Lu转移载体的构建 | 第54-55页 |
| ·重组杆状病毒的组建 | 第55页 |
| ·表达活性测定 | 第55-56页 |
| ·讨论 | 第56-59页 |
| ·昆虫杆状病毒杀虫剂研究和应用上存在主要问题的分析 | 第56-57页 |
| ·科学家解决上述问题的主要思路和方法 | 第57页 |
| ·高效快速表达模型的技术创新 | 第57-58页 |
| ·高效表达载体的选择 | 第58-59页 |
| 第三章 蜘蛛毒素基因(ω-ACTX-Hv2a)的设计、合成、克隆及其定点突变的研究 | 第59-77页 |
| ·分泌型蜘蛛毒素基因(ω-ACTX-Hv2a)的设计 | 第59-62页 |
| ·ω-ACTX-Hv2a蜘蛛毒素的结构和AA组成 | 第59-60页 |
| ·分泌型ω-ACTX-Hv2a基因人工合成设计依据与思路 | 第60-62页 |
| ·蜘蛛毒素基因(ω-ACTX-Hv2a)的合成、克隆及定点突变 | 第62-74页 |
| ·材料 | 第62-63页 |
| ·载体与宿主菌 | 第62页 |
| ·酶与试剂 | 第62页 |
| ·培养基 | 第62页 |
| ·缓冲液与溶液 | 第62-63页 |
| ·方法 | 第63-69页 |
| ·蜘蛛毒素基因(ω-ACTX-Hv2a)的合成、克隆 | 第63-68页 |
| ·Hv2a基因引物合成设计 | 第63-65页 |
| ·分泌型Hv2a基因片段的合成 | 第65-67页 |
| ·凝胶回收连接产物 | 第67页 |
| ·Hv2a基因片段与PCR-BLUNT vector连接 | 第67页 |
| ·宿主菌E.coli XL-2-Blue超级感受态细胞的制备 | 第67-68页 |
| ·连接产物转化宿主菌E.coli XL-2-Blue菌株的超级感受态细胞 | 第68页 |
| ·质粒的提取 | 第68页 |
| ·质粒的酶切鉴定 | 第68页 |
| ·序列分析 | 第68页 |
| ·人工合成分泌型ω-ACTX-Hv2a基因的定点修复 | 第68-69页 |
| ·基因突变引物设计 | 第68-69页 |
| ·基因突变方法 | 第69页 |
| ·序列分析 | 第69页 |
| ·结果与分析 | 第69-74页 |
| ·分泌型ω-ACTX-Hv2a基因的合成及克隆 | 第69-72页 |
| ·DNA片段A(A1-A2)和H(H3-H4)的合成 | 第69-70页 |
| ·Hv2A基因DNA片段的合成 | 第70页 |
| ·分泌型ω-ACTX-Hv2a基因的克隆及序列分析 | 第70-72页 |
| ·合成的分泌型ω-ACTX-Hv2a基因的修饰 | 第72-74页 |
| ·第1次基因修饰结果 | 第73-74页 |
| ·第2次基因修饰结果 | 第74页 |
| ·讨论 | 第74-77页 |
| 第四章 载有蜘蛛毒素基因(ω-ACTX-Hv2a)的重组杆状病毒的组建及其杀虫活性初试 | 第77-90页 |
| ·材料与方法 | 第77-81页 |
| ·材料 | 第77-78页 |
| ·方法 | 第78-81页 |
| ·转移载体pAcE1-Hv2a的构建 | 第78-79页 |
| ·转移载体pAcE1的制备 | 第78页 |
| ·pACE1转移载体EcoRI-BamHI大片段的制备 | 第78页 |
| ·pACE1转移载体XhoI-BamHI片段的制备 | 第78页 |
| ·BP-Hv2a载体EcoR I-Xho I(Hv2a)片段的制备 | 第78-79页 |
| ·DNA片段连接组建转移载体pAcE1-Hv2a | 第79页 |
| ·转化 | 第79页 |
| ·质粒DNA提取 | 第79页 |
| ·酶切鉴定 | 第79页 |
| ·转染和共转染 | 第79页 |
| ·病毒的繁殖 | 第79-80页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第80页 |
| ·重组杆状病毒rbpAcE1-Hv2a杀虫效果生物测定实验 | 第80-81页 |
| ·处理设计 | 第80-81页 |
| ·具体方法 | 第81页 |
| ·结果与分析 | 第81-86页 |
| ·pACE1转移载体EcoRI-BamHI大片段、XhoI-BamHI片段以及Hv2a基因片段的制备 | 第81-82页 |
| ·pAcE1-Hv2a转移载体的构建 | 第82页 |
| ·含蜘蛛毒素基因重组病毒(rbpAcE1-Hv2a)的组建 | 第82页 |
| ·重组杆状病毒(rbpAcE1-Hv2a)和野生型杆状病毒(AcNPV)对马尾松毛虫的杀虫活性 | 第82-84页 |
| ·重组杆状病毒和野生型杆状病毒对松毛虫的杀虫症状比较 | 第84-86页 |
| ·讨论 | 第86-90页 |
| ·插入毒素基因,提高杀虫效果 | 第86-88页 |
| ·杆状病毒表达载体的短肽表达 | 第88页 |
| ·杆状病毒杀虫剂研究展望 | 第88-90页 |
| 第五章 结论 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-103页 |
| 致谢 | 第103页 |
