| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-28页 |
| 1.植酸的结构、性质、作用及分布 | 第11-13页 |
| ·植酸的物理与化学性质 | 第11页 |
| ·植酸的作用 | 第11-13页 |
| ·植酸的分布 | 第13页 |
| 2.植酸酶的来源、分类、性质、作用机理及酶活检测方法 | 第13-21页 |
| ·植酸酶的来源 | 第13-15页 |
| ·真菌植酸酶 | 第14页 |
| ·细菌植酸酶 | 第14页 |
| ·酵母植酸酶 | 第14-15页 |
| ·瘤胃中的植酸酶 | 第15页 |
| ·植酸酶的分类 | 第15-18页 |
| ·组氨酸酸性磷酸酶类植酸酶 | 第16-17页 |
| ·β-螺旋桨植酸酶 | 第17-18页 |
| ·紫色酸性磷酸酶 | 第18页 |
| ·植酸酶的性质 | 第18-19页 |
| ·植酸酶的作用机理 | 第19-20页 |
| ·酶活检测方法 | 第20-21页 |
| 3.植酸酶的应用、限制因素及解决办法 | 第21-23页 |
| ·植酸酶的应用及商业化 | 第21页 |
| ·限制植酸酶工业应用的主要因素 | 第21-22页 |
| ·提高植酸酶的耐热性主要采取的策略 | 第22-23页 |
| 4.植酸酶的分子生物学 | 第23-27页 |
| ·植酸酶基因的克隆 | 第23-24页 |
| ·植酸酶的分子生物学 | 第24-25页 |
| ·植酸酶基因的表达 | 第25-27页 |
| ·植酸酶基因在微生物中的表达研究 | 第25-26页 |
| ·植酸酶基因在植物中的表达研究 | 第26页 |
| ·植酸酶基因在动物中的表达研究 | 第26-27页 |
| 5.本课题的立题依据 | 第27-28页 |
| 第二章 曲霉产植酸酶菌种中phyA基因的克隆策略 | 第28-45页 |
| 1.实验材料 | 第28-29页 |
| ·菌株、质粒及遗传特性 | 第28页 |
| ·主要试剂 | 第28-29页 |
| ·培养基及培养条件 | 第29页 |
| 2.实验方法 | 第29-38页 |
| ·曲霉总DNA、总RNA和单链cDNA的制备 | 第29-32页 |
| ·菌体的制备 | 第29-30页 |
| ·A.niger和A.oryzae总RNA的提取 | 第30页 |
| ·A.niger和A.oryzae总DNA的提取 | 第30-31页 |
| ·总RNA和总DNA的质量检测 | 第31页 |
| ·A.niger和A.oryzae mRNA的反转录 | 第31-32页 |
| ·CODEHOP PCR技术克隆植酸酶基因中间部分序列 | 第32-34页 |
| ·克隆部分植酸酶基因序列的CODEHOP引物设计 | 第32-33页 |
| ·CODEHOP PCR扩增部分植酸酶基因序列 | 第33页 |
| ·CODEHOP PCR产物TA克隆、序列测定及筛选 | 第33-34页 |
| ·TAIL-PCR扩增植酸酶基因的5'及3'端未知序列 | 第34-37页 |
| ·TAIL-PCR引物的设计 | 第35-36页 |
| ·TAIL-PCR的反应体系及程序 | 第36-37页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳分析TAIL-PCR产物,测序 | 第37页 |
| ·根据测得的5'和3'端序列,进行全序列组装 | 第37页 |
| ·A.niger和A.oryzae phyA cDNA的克隆 | 第37-38页 |
| ·目的cDNA的扩增 | 第37-38页 |
| ·植酸酶cDNAs及其编码的蛋白分析 | 第38页 |
| 3.结果与讨论 | 第38-44页 |
| ·总RNA和总DNA质量检测分析 | 第38-39页 |
| ·总RNA和总DNA浓度与纯度 | 第38页 |
| ·结果分析 | 第38-39页 |
| ·CODEHOP PCR产物电泳及序列分析 | 第39-40页 |
| ·电泳结果及序列比对 | 第39页 |
| ·讨论 | 第39-40页 |
| ·TAIL-PCR引物及反应程序设计 | 第40-41页 |
| ·TAIL-PCR引物设计的原则 | 第40-41页 |
| ·TAIL-PCR反应程序设置分析 | 第41页 |
| ·TAIL-PCR产物电泳分析 | 第41-43页 |
| ·A.niger和A.oryzae cDNA克隆结果 | 第43页 |
| ·A.niger和A.oryzae植酸酶基因全序列拼接及分析 | 第43-44页 |
| ·A.niger和A.oryzae植酸酶基因全序列拼接 | 第43页 |
| ·克隆得到的植酸酶基因及其编码的蛋白质分析 | 第43-44页 |
| 4.本章小结 | 第44-45页 |
| 第三章 曲霉phyA在毕赤酵母中的分泌表达 | 第45-60页 |
| 1.实验材料 | 第45-46页 |
| ·菌株与质粒 | 第45页 |
| ·主要试剂 | 第45-46页 |
| ·培养基 | 第46页 |
| 2.实验方法 | 第46-52页 |
| ·重组表达质粒pPIC9-x的构建及转化Pichia pastoris GS115 | 第46-48页 |
| ·重组表达质粒pPIC9-x的构建 | 第46-47页 |
| ·重组表达质粒pPIC9-x的获得 | 第47页 |
| ·P.pastoris GS115的转化及重组酵母的验证 | 第47-48页 |
| ·重组酵母GS115-pPIC9-x的筛选、验证及表型鉴定 | 第48-49页 |
| ·重组酵母GS115-pPIC9-x的筛选 | 第48页 |
| ·重组酵母GS115-pPIC9-x的验证 | 第48-49页 |
| ·重组酵母表型的鉴定 | 第49页 |
| ·重组酵母的诱导表达及产物性质分析 | 第49-51页 |
| ·高产植酸酶重组酵母的筛选及发酵进程曲线绘制 | 第49-50页 |
| ·表达产物的性质分析 | 第50-51页 |
| ·rPhyAs的脱糖基化及SDS-PAGE分析 | 第51-52页 |
| ·rPhyAs的脱糖基化 | 第51-52页 |
| ·SDS-PAGE | 第52页 |
| 3.结果与讨论 | 第52-57页 |
| ·重组表达质粒pPIC9-x的构建 | 第52-53页 |
| ·P.pastoris重组子的筛选 | 第53-54页 |
| ·重组酵母GS115-pPIC9-x的验证 | 第54-55页 |
| ·高产植酸酶重组酵母的筛选及发酵进程曲线 | 第55-56页 |
| ·标准曲线及发酵进程曲线 | 第55-56页 |
| ·表达过程的调控及培养基选择分析 | 第56页 |
| ·rPhyAs的性质研究 | 第56-57页 |
| ·rPhyAs的脱糖基化及SDS-PAGE分析 | 第57页 |
| 4.本章小结 | 第57-60页 |
| 论文后续工作展望 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 附录 | 第68-72页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第72页 |
