| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 文献综述 | 第12-28页 |
| 1 P450研究进展 | 第12-16页 |
| ·P450分布与命名 | 第12页 |
| ·P450结构特征 | 第12-14页 |
| ·P450主要功能 | 第14-15页 |
| ·P450酶系的催化机制 | 第15-16页 |
| 2 人细胞色素P450 3A4及其单核苷酸多态性的研究进展 | 第16-22页 |
| ·3A4在P450中的重要地位 | 第16-17页 |
| ·3A4 SNPs存在及意义 | 第17-20页 |
| ·SNP的概念 | 第17-18页 |
| ·SNP的检测与分析技术 | 第18页 |
| ·3A4 SNPs存在及意义 | 第18-20页 |
| ·3A4 SNPs应用前景 | 第20-22页 |
| ·3A4 SNPs与新药的开发和筛选 | 第20-21页 |
| ·3A4 SNPs与个体化用药 | 第21页 |
| ·3A4 SNPs其它应用 | 第21-22页 |
| 3 反式剪接形成的CYP3A43/3A4的研究 | 第22-25页 |
| ·概念 | 第22页 |
| ·反式剪接机制 | 第22-24页 |
| ·CYP3A43/3A4的研究 | 第24-25页 |
| 4 立题背景及意义 | 第25-28页 |
| 实验内容 | 第28-56页 |
| 一 CYP3A4原生株及其突变株的基因克隆,蛋白表达及酶活性检测 | 第28-49页 |
| 1 材料 | 第29-31页 |
| ·载体和菌株 | 第29页 |
| ·试剂 | 第29页 |
| ·主要溶液和培养基 | 第29-30页 |
| ·主要仪器 | 第30-31页 |
| 2 方法 | 第31-38页 |
| ·人肝脏细胞色素P450 3A4原生株重组质粒的构建 | 第31-33页 |
| ·3A4 cDNA扩增 | 第31页 |
| ·3A4 cDNA双酶切 | 第31-32页 |
| ·载体pYES2/CT制备 | 第32页 |
| ·目的片段与载体连接 | 第32页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
| ·化学转化 | 第33页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第33页 |
| ·人肝脏细胞色素P450 3A4突变株重组质粒的构建 | 第33-35页 |
| ·特异性引物的设计 | 第33-34页 |
| ·重叠延伸PCR法引入定点突变 | 第34-35页 |
| ·转化3A4 SNPs的cDNA到pYES2/CT表达载体中 | 第35页 |
| ·重组酵母菌株构建和诱导表达 | 第35页 |
| ·免疫印迹杂交鉴定 | 第35-36页 |
| ·大量诱导表达并制备酵母微粒体 | 第36页 |
| ·Bradford法测定酵母微粒体蛋白浓度 | 第36-37页 |
| ·牛血清白蛋白标准曲线制备 | 第36页 |
| ·微粒体样品中蛋白质浓度的测定 | 第36-37页 |
| ·酶活性检测 | 第37页 |
| ·酶动力学参数测定 | 第37页 |
| ·药物抑制性实验 | 第37-38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-44页 |
| ·获得3A4 cDNA | 第38-39页 |
| ·获得CYP3A4 SNPs cDNA | 第39页 |
| ·成功构建SNPs重组子 | 第39-40页 |
| ·重组表达蛋白的Western-blot分析 | 第40页 |
| ·牛血清白蛋白标准曲线 | 第40-41页 |
| ·酶活性检测 | 第41-42页 |
| ·CYP3A4酶动力学参数测定 | 第42-44页 |
| ·CYP3A4原生株及突变株酶的药物抑制性实验 | 第44页 |
| 4 讨论 | 第44-49页 |
| 二 反式剪接形成的人类细胞色素P450嵌合体3A43/3A4的研究 | 第49-56页 |
| 1 材料 | 第49-50页 |
| 2 方法 | 第50-51页 |
| ·CYP3A43/3A4重组质粒的构建 | 第50-51页 |
| ·CYP3A43/3A4 cDNA扩增 | 第50页 |
| ·构建CYP3A43/3A4重组质粒 | 第50-51页 |
| ·重组酵母菌株的构建和诱导表达 | 第51页 |
| ·western-blot鉴定 | 第51页 |
| ·大量诱导表达并制备酵母微粒体 | 第51页 |
| ·CYP3A43/3A4酶动力学性质的测定 | 第51页 |
| 3 结果 | 第51-54页 |
| ·获得3A43/3A4 cDNA | 第51-52页 |
| ·重组表达蛋白Western-blot分析 | 第52页 |
| ·CYP3A43/3A4杂合酶的活性检测 | 第52页 |
| ·CYP3A43/3A4杂合酶的动力学参数测定 | 第52-53页 |
| ·CYP3A43/3A4杂合酶抑制性实验 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-56页 |
| 全文总结 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 附表 | 第65-68页 |
