| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-15页 |
| 缩略语表 | 第15-17页 |
| 第一章 前言 | 第17-61页 |
| 1 放线菌概述 | 第17-18页 |
| 2 放线菌基因组研究 | 第18-28页 |
| ·放线菌基因组测序 | 第19-25页 |
| ·天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)基因组 | 第25-28页 |
| 3 放线菌遗传因子及其复制 | 第28-32页 |
| ·放线菌染色体的复制 | 第28页 |
| ·放线菌线型质粒的复制 | 第28-30页 |
| ·放线菌环型质粒的复制 | 第30-32页 |
| ·滚环复制(rolling circle replication,RCR)质粒 | 第30-32页 |
| ·θ复制质粒 | 第32页 |
| 4 除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)及其阿维菌素(Avermectin) | 第32-43页 |
| ·除虫链霉菌概述 | 第32-33页 |
| ·阿维菌素的生物合成 | 第33-38页 |
| ·阿维菌素的生物合成途径 | 第33-34页 |
| ·阿维菌素的生物合成基因簇 | 第34-38页 |
| ·阿维菌素生物合成突变株 | 第34-35页 |
| ·阿维菌素的生物合成基因簇 | 第35-37页 |
| ·阿维菌素生物合成基因功能 | 第37-38页 |
| ·除虫链霉菌基因组 | 第38-41页 |
| ·阿维菌素次生代谢工程研究进展及存在的问题 | 第41-43页 |
| ·阿维菌素生物合成的结构基因的改造 | 第41-42页 |
| ·阿维菌素生物合成调节基因的改造 | 第42-43页 |
| 5 尤马马杜拉放线菌(Actinomadura yumaensis)及其马杜拉霉素 | 第43-47页 |
| ·马杜拉霉素的基本性质 | 第44-45页 |
| ·马杜拉霉素的生物合成 | 第45-47页 |
| 6 放线菌的次生代谢工程的策略 | 第47-58页 |
| ·改善限速步骤的基因 | 第47页 |
| ·操纵调节基因 | 第47-48页 |
| ·增加抗性基因的拷贝数 | 第48页 |
| ·异源表达抗生素生物合成基因 | 第48-49页 |
| ·阻断支路代谢,增加目标产物的产量 | 第49-50页 |
| ·沉默基因(Silent genes)的表达 | 第50-51页 |
| ·突变生物合成 | 第51-53页 |
| ·组合生物合成 | 第53-56页 |
| ·引进组合抗性基因突变 | 第56页 |
| ·代谢流控制 | 第56-58页 |
| 7 本论文研究的目的及其意义 | 第58-61页 |
| ·有序排列的放线菌基因组文库的构建及应用 | 第58-59页 |
| ·除虫链霉菌基因组文库的构建及应用 | 第58页 |
| ·利用正调控基因进行除虫链霉菌次生代谢工程的研究 | 第58页 |
| ·天蓝色链霉菌有序基因组文库的构建及应用 | 第58-59页 |
| ·马杜拉霉素产生菌的基因组文库的构建及应用 | 第59页 |
| ·放线菌遗传因子的研究 | 第59-61页 |
| ·链霉菌温敏线型质粒pRL4复制区的鉴定 | 第59页 |
| ·诺卡氏菌小环型质pXT107的研究 | 第59页 |
| ·尤马马杜拉放线菌染色体基本复制区克隆 | 第59-61页 |
| 第二章 材料与方法 | 第61-86页 |
| 1 材料 | 第61-67页 |
| ·菌株 | 第61-62页 |
| ·质粒 | 第62页 |
| ·培养基 | 第62-66页 |
| ·液体培养基 | 第62-63页 |
| ·固体培养基 | 第63-65页 |
| ·发酵培养基 | 第65-66页 |
| ·抗生素 | 第66页 |
| ·酶和生化试剂 | 第66-67页 |
| 2 方法 | 第67-86页 |
| ·大肠杆菌(Escherichia coli)质粒提取 | 第67页 |
| ·快速小量制备质粒DNA | 第67页 |
| ·大肠杆菌转化子的快速检测 | 第67页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第67-69页 |
| ·E.coli的Ca~(2+)法感受态细胞的制备及转化 | 第67-68页 |
| ·E.coli电击感受态细胞的制备转化 | 第68页 |
| ·λRED介导PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 | 第68-69页 |
| ·放线菌培养 | 第69-70页 |
| ·放线菌孢子悬液的制备 | 第69页 |
| ·放线菌孢子的预萌发 | 第69-70页 |
| ·阿维菌素的发酵及检测 | 第70页 |
| ·发酵培养 | 第70页 |
| ·发酵产物组分含量测定 | 第70页 |
| ·放线菌DNA的提取 | 第70-72页 |
| ·放线菌环型质粒DNA的少量抽取 | 第70-71页 |
| ·放线菌基因组DNA的大量抽提 | 第71页 |
| ·放线菌基因组DNA少量抽提 | 第71-72页 |
| ·放线菌DNA的遗传转化 | 第72-74页 |
| ·原生质体制备 | 第72页 |
| ·用质粒DNA转化链霉菌的原生质体(初始方法) | 第72-73页 |
| ·用质粒DNA转化链霉菌的原生质体(小规模快速方法) | 第73页 |
| ·大肠杆菌与放线菌间的接合转移操作流程 | 第73-74页 |
| ·放线菌电转化感受态细胞的制备及其电转化 | 第74页 |
| ·DNA体外操作 | 第74-77页 |
| ·限制性核酸内切酶酶切DNA | 第74页 |
| ·DNA去磷酸化 | 第74-75页 |
| ·DNA3’凹端补平和3’突出端的去除 | 第75页 |
| ·DNA体外连接反应 | 第75页 |
| ·DNA的PCR扩增反应 | 第75页 |
| ·基因组DNA部分酶切及回收 | 第75-77页 |
| ·部分酶切条件的建立 | 第75-76页 |
| ·大规模制备部分酶切的基因组DNA | 第76页 |
| ·基因组DNA片段的大小分部(Size fractionation) | 第76-77页 |
| ·柯斯(cosmid)文库的构建 | 第77-79页 |
| ·柯斯文库构建流程 | 第77页 |
| ·柯斯质粒载体的准备 | 第77页 |
| ·连接体系的建立 | 第77-78页 |
| ·连接混合物的包装及文库转染 | 第78-79页 |
| ·柯斯质粒基因组文库质量检测 | 第79页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳(Sambrook and Russell ,2001) | 第79-82页 |
| ·普通琼脂糖凝胶电泳 | 第79-80页 |
| ·脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis) | 第80-82页 |
| ·脉冲电泳样品制备 | 第80-81页 |
| ·脉冲场电泳样品酶切 | 第81页 |
| ·脉冲场电泳操作 | 第81-82页 |
| ·琼脂糖凝胶中目的DNA片段的回收 | 第82-83页 |
| ·柱回收法 | 第82-83页 |
| ·琼脂糖酶法 | 第83页 |
| ·DNA杂交技术 | 第83-85页 |
| ·DNA向尼龙膜的毛细管转移 | 第83-84页 |
| ·同位素标记DNA探针 | 第84页 |
| ·DNA杂交实验 | 第84-85页 |
| ·菌落原位杂交(colony in situ hybridization) | 第85-86页 |
| ·菌落DNA释放及固定 | 第85页 |
| ·菌落原位杂交 | 第85-86页 |
| 第三章 结果与分析 | 第86-158页 |
| 第一节 有序排列的基因组文库的构建及其应用 | 第86-142页 |
| 1 除虫链霉菌有序排列的基因组文库的构建及其应用 | 第88-112页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第88页 |
| ·利用柯斯载体SuperCosl构建基因组文库 | 第88-90页 |
| ·基因组DNA的部分酶切 | 第88-89页 |
| ·基因组文库的构建及质量检测 | 第89-90页 |
| ·有序排列的基因组文库的获得 | 第90-91页 |
| ·有序排列的基因组文库的应用 | 第91-109页 |
| ·建立高效基因替换策略 | 第91-94页 |
| ·高效基因替换的实施 | 第94-96页 |
| ·抗生素次生代谢工程 | 第96-101页 |
| ·抗生素生物合成结构基因的研究 | 第101-108页 |
| ·抗生素生物合成调控基因功能的研究 | 第108-109页 |
| ·小结 | 第109-112页 |
| 2 利用正调控基因改造阿维菌素和多拉菌素(Doramectin)产生菌 | 第112-117页 |
| ·正调控基因的获得 | 第113-114页 |
| ·正调控基因导入除虫链霉菌并测定稳定性 | 第114-115页 |
| ·正调控基因的效果检测 | 第115-117页 |
| ·调控基因afsR,aveR和orfX均对阿维菌素的工业生产菌株MMR630中Bla组分产量的影响 | 第115页 |
| ·多种调控基因中对多拉菌素工业生产菌株G11的产量的影响 | 第115-117页 |
| ·带有强启动子perm E~*的调控基因afsB降低了工业生产菌株G11中多拉菌素的含量 | 第117页 |
| ·小结 | 第117页 |
| 3 利用新型柯斯载体构建有序排列的天蓝色链霉菌和除虫链霉菌的基因组文库 | 第117-132页 |
| ·链霉菌基因组DNA的抽提 | 第117-118页 |
| ·基因组文库的构建 | 第118-121页 |
| ·基因组DNA部分酶切 | 第118-119页 |
| ·文库的构建及质量检测 | 第119-120页 |
| ·有序排列的基因组文库的获得 | 第120-121页 |
| ·新型柯斯载体pHAQ31构建的二个基因组文库及其应用 | 第121-128页 |
| ·高效基因敲除策略 | 第121-123页 |
| ·除虫链霉菌基因组文库的构建及其基因组大片段DNA敲除 | 第123-126页 |
| ·天蓝色链霉菌有序文库的构建及其基因簇敲除 | 第126-128页 |
| ·组合pHAQ31和SuperCos1构建的除虫链霉菌基因组文库进行基因组大片段DNA敲除 | 第128-132页 |
| ·小结 | 第132页 |
| 4 尤马马杜拉放线菌基因组文库的构建及马杜拉霉素生物合成基因簇的克隆 | 第132-142页 |
| ·尤马马杜拉放线菌基因组DNA的抽提 | 第133-134页 |
| ·基因组文库的构建 | 第134-136页 |
| ·基因组DNA的部分酶切 | 第134页 |
| ·基因组文库的构建 | 第134-136页 |
| ·尤马马杜拉放线菌内源聚酮合成酶探针的获得 | 第136-139页 |
| ·聚酮合成酶及酰基转移酶探针菌落杂交筛选生物合成相关的阳性克隆 | 第139-140页 |
| ·阳性克隆两端测序结果 | 第140-141页 |
| ·小结 | 第141-142页 |
| 第二节 放线菌遗传因子复制的研究 | 第142-158页 |
| 1 链霉菌44414(Streptomyces sp.44414)中温敏性线型质粒pRL4的研究 | 第142-148页 |
| ·pRL4温敏性检测 | 第143页 |
| ·pRL4复制区的克隆及序列分析 | 第143-144页 |
| ·pRL4复制区的序列分析 | 第144-145页 |
| ·pRL4最小复制区的鉴定 | 第145-146页 |
| ·pRL4最小复制区的分析及线型质粒SAP1中心复制区的研究 | 第146-147页 |
| ·小结 | 第147-148页 |
| 2 诺卡氏菌环型质粒pXT107研究 | 第148-152页 |
| ·pXT107的分离及克隆 | 第148页 |
| ·pXT107的序列分析 | 第148-151页 |
| ·pXT107的复制功能分析 | 第151页 |
| ·小结 | 第151-152页 |
| 3 尤马马杜拉放线菌染色体的复制起始区(oriC)克隆 | 第152-158页 |
| ·染色体复制区的克隆 | 第152-153页 |
| ·染色体复制区的序列分析 | 第153-155页 |
| ·染色体复制区的功能研究 | 第155页 |
| ·染色体oriC的进化树分析 | 第155-156页 |
| ·小结 | 第156-158页 |
| 第四章 讨论 | 第158-161页 |
| 参考文献 | 第161-176页 |
| 发表文章目录 | 第176-177页 |
| 致谢 | 第177页 |
