| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 符号与缩略语说明 | 第15-16页 |
| 前言 | 第16-17页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-67页 |
| 第一章 农药污染的微生物修复研究进展 | 第17-27页 |
| 1 农药污染的微生物修复背景 | 第17-18页 |
| 2 降解农药的微生物及其研究 | 第18-19页 |
| ·降解农药的微生物 | 第18-19页 |
| ·农药微生物降解的代谢途径与降解基因 | 第19页 |
| ·农药微生物修复的影响因素 | 第19页 |
| 3 农药污染土壤的微生物修复研究 | 第19-22页 |
| 4 农药污染土壤的微生物修复的产业化 | 第22页 |
| 5 农药污染土壤的微生物修复的前景与展望 | 第22-23页 |
| 参考文献 | 第23-27页 |
| 第二章 鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)细菌综述 | 第27-47页 |
| 1 鞘氨醇单胞菌属的分类和系统发育分析 | 第27页 |
| 2 鞘氨醇单胞菌属的生境 | 第27-28页 |
| 3 鞘氨醇单胞菌的分离 | 第28页 |
| 4 鞘氨醇单胞菌的培养 | 第28页 |
| 5 鞘氨醇单胞菌的鉴定 | 第28-29页 |
| 6 鞘氨醇单胞菌的保藏 | 第29页 |
| 7 鞘氨醇单胞菌对化合物的代谢 | 第29-32页 |
| 8 鞘氨醇单胞菌胞外生物多聚物 | 第32页 |
| 9 鞘氨醇单胞菌膜结构 | 第32-33页 |
| 10 鞘氨醇单胞菌寡营养类型 | 第33页 |
| 11 鞘氨醇单胞菌的遗传学 | 第33页 |
| 12 鞘氨醇单胞菌基因组学 | 第33-35页 |
| 13 鞘氨醇单胞菌的生态学 | 第35-36页 |
| 14 鞘氨醇单胞菌的致病性 | 第36-37页 |
| 15 鞘氨醇单胞菌的生物技术应用 | 第37-38页 |
| 参考文献 | 第38-47页 |
| 第三章 同源重组研究进展 | 第47-55页 |
| 1 同源重组的类型 | 第48页 |
| 2 参与同源重组的蛋白和功能 | 第48页 |
| 3 同源重组模型 | 第48-49页 |
| ·Holliday模型 | 第48-49页 |
| ·Meselson-Radding模型 | 第49页 |
| ·双链断裂修复模型 | 第49页 |
| ·单链退火模型 | 第49页 |
| 4 基因打靶实验设计策略 | 第49-50页 |
| 5 同源重组的方式 | 第50-51页 |
| 6 整合载体的整合位点 | 第51页 |
| 7 基因打靶技术发展的三个阶段 | 第51-52页 |
| ·自身可作选择标记的特殊基因的同源重组 | 第51页 |
| ·采用正负选择(Positive and Negative Selection)系统的同源重组 | 第51页 |
| ·对靶位点进行精细操作的同源重组 | 第51-52页 |
| 8 二步选择法中的双交换的反筛选标记(Counter selectable marker) | 第52页 |
| ·镰孢酸(fusaric acid)敏感系统 | 第52页 |
| ·链霉素敏感系统(Streptomycin sensitivity system) | 第52页 |
| ·蔗糖敏感系统(The sucrose sensitivity system) | 第52页 |
| 9 同源重组效率的影响因素 | 第52-53页 |
| ·同源重组指导序列(HRDS)长度对重组效率的影响 | 第53页 |
| ·同源重组指导序列(HRDS)的同源性对重组效率的影响 | 第53页 |
| ·打靶位点的拷贝数与染色体位置 | 第53页 |
| 10 Red同源重组系统 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-55页 |
| 第四章 转基因微生物及其安全评价研究进展 | 第55-67页 |
| 1 转基因生物的发展概况 | 第55-57页 |
| 2 转基因生物的安全性 | 第57-59页 |
| ·生态环境方面 | 第57页 |
| ·生物多样性方面 | 第57-58页 |
| ·影响人体健康方面 | 第58-59页 |
| 3 转基因微生物的安全性评价 | 第59-65页 |
| ·转基因微生物的检测与监控 | 第59-63页 |
| ·微生物群落结构与多样性研究 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-67页 |
| 第二部分 实验部分 | 第67-160页 |
| 第一章 遗传稳定多功能农药降解基因工程菌的构建 | 第67-85页 |
| 1 材料与方法 | 第67-74页 |
| ·菌株质粒及培养基 | 第67-68页 |
| ·培养基与培养条件 | 第68-69页 |
| ·试剂与材料 | 第69页 |
| ·菌体总DNA的提取 | 第69页 |
| ·16S rDNA的PCR扩增 | 第69页 |
| ·mpd基因的扩增 | 第69-70页 |
| ·PCR产物的T/A克隆 | 第70页 |
| ·E. coli DH5α普通感受态细胞的制备 | 第70页 |
| ·DNA酶切反应体系的建立 | 第70页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第70-71页 |
| ·酶切片段回收 | 第71页 |
| ·载体脱磷 | 第71页 |
| ·酶连 | 第71页 |
| ·转化 | 第71页 |
| ·16S rDNA的序列系统进化树建立 | 第71页 |
| ·二亲接合 | 第71-72页 |
| ·同源重组事件的PCR验证 | 第72页 |
| ·同源重组事件的Southern杂交验证 | 第72-74页 |
| 2 结果与分析 | 第74-81页 |
| ·受体菌Sphingomonas agrestis CDS-1基本生物学特性 | 第74页 |
| ·CDS-1染色体总DNA的提取及16S rRNA基因的PCR扩增 | 第74-75页 |
| ·同源重组载体的构建 | 第75-77页 |
| ·同源重组子的筛选策略 | 第77-79页 |
| ·同源重组子的获得及同源重组事件的PCR、Southern杂交验证 | 第79-81页 |
| 3 讨论 | 第81-82页 |
| 本章小结 | 第82页 |
| 参考文献 | 第82-85页 |
| 第二章 影响同源重组效率的关键参数研究 | 第85-95页 |
| 1 材料与方法 | 第85-87页 |
| ·菌株及质粒 | 第85页 |
| ·含不同长度同源臂的同源重组载体的构建 | 第85页 |
| ·λRed同源重组载体的构建 | 第85-87页 |
| ·λRed同源重组中的二亲接合 | 第87页 |
| ·基因序列登录号(Nucleotide sequence accession numbers) | 第87页 |
| 2 结果与分析 | 第87-92页 |
| ·同源片段长度对同源重组效率的影响 | 第87-89页 |
| ·同源重组指导序列差异性对同源重组效率的影响 | 第89-91页 |
| ·λRed重组系统对同源重组效率的影响 | 第91-92页 |
| 3 讨论 | 第92-93页 |
| 本章小结 | 第93页 |
| 参考文献 | 第93-95页 |
| 第三章 基因工程菌株的生物学和降解特性研究 | 第95-113页 |
| 1 材料与方法 | 第95-99页 |
| ·菌株与材料 | 第95-96页 |
| ·试剂 | 第96页 |
| ·培养基 | 第96页 |
| ·菌体生长量的测定 | 第96页 |
| ·农药提取和检测方法 | 第96-97页 |
| ·菌株生长和降解条件试验 | 第97页 |
| ·农药降解影响因素研究 | 第97页 |
| ·农药降解广谱性实验 | 第97页 |
| ·mpd基因在Sphingomonas agrestis CDS-1染色体上的随机插入 | 第97-98页 |
| ·细胞的高压压榨破碎 | 第98页 |
| ·甲基对硫磷水解酶(MPH)酶活测定 | 第98-99页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析 | 第99页 |
| ·MPH的酶谱分析 | 第99页 |
| 2 结果与分析 | 第99-111页 |
| ·mpd基因在Sphingomonas sp菌株rrn位点的重组对受体菌的影响 | 第99-101页 |
| ·基因工程菌的遗传稳定性 | 第101-102页 |
| ·甲基对硫磷水解酶MPH在工程菌中的表达 | 第102-104页 |
| ·农药降解与菌株生长的关系 | 第104-107页 |
| ·接种量对农药降解的影响 | 第107-108页 |
| ·通气量对农药降解的影响 | 第108页 |
| ·温度对农药降解的影响 | 第108-109页 |
| ·初始pH对降解农药的影响 | 第109页 |
| ·外加碳源对农药降解的影响 | 第109-110页 |
| ·工程菌Sphingomonas sp. CDS-mpd的农药降解谱 | 第110-111页 |
| 3 讨论 | 第111页 |
| 本章小结 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-113页 |
| 第四章 mpd基因在Pseudomonas putida KT2440 16S rDNA位点的多拷贝重组 | 第113-119页 |
| 1 材料与方法 | 第113-114页 |
| ·菌株与质粒 | 第113页 |
| ·酶活初测 | 第113-114页 |
| 2 结果与分析 | 第114-117页 |
| ·mpd基因在16S rDNA位点的多拷贝重组 | 第114-115页 |
| ·多次位点重组的同源重组效率 | 第115页 |
| ·多次重组对菌株生长能力的影响 | 第115-116页 |
| ·多拷贝重组子的稳定性 | 第116页 |
| ·不同mpd基因拷贝数重组子的酶活比较 | 第116-117页 |
| 3 讨论 | 第117-118页 |
| 本章小结 | 第118页 |
| 参考文献 | 第118-119页 |
| 第五章 多功能农药降解基因工程菌剂保藏条件研究 | 第119-127页 |
| 1 材料与方法 | 第119-121页 |
| ·菌株 | 第119页 |
| ·载体及来源 | 第119页 |
| ·工程菌计数方法 | 第119页 |
| ·单一载体吸菌量的测定 | 第119-120页 |
| ·不同剂型保藏试验 | 第120页 |
| ·不同接种量保藏试验 | 第120页 |
| ·保护剂选择试验 | 第120页 |
| ·工程菌剂降解农药的盆钵试验 | 第120-121页 |
| ·土壤中农药的提取和测定 | 第121页 |
| 2 结果与分析 | 第121-125页 |
| ·单一载体最大吸菌量试验 | 第121页 |
| ·不同剂型的菌剂保藏试验 | 第121-122页 |
| ·工程菌剂接种量对保藏效果的影响 | 第122-123页 |
| ·添加保护剂对保藏效果的影响 | 第123-124页 |
| ·工程菌株降解两种农药的土壤盆钵试验 | 第124-125页 |
| 3 讨论 | 第125-126页 |
| 本章小结 | 第126页 |
| 参考文献 | 第126-127页 |
| 第六章 工程菌环境释放农药降解效果及定殖动态研究 | 第127-149页 |
| 1 材料与方法 | 第127-134页 |
| ·菌剂与农药 | 第127-128页 |
| ·试验条件 | 第128-129页 |
| ·试验方法 | 第129-131页 |
| ·工程菌的平板计数 | 第131页 |
| ·土壤总DNA的提取 | 第131-132页 |
| ·土壤中特异靶标DNA的PCR检测灵敏度 | 第132-133页 |
| ·Most Probable Number-PCR(MPN-PCR)方法 | 第133页 |
| ·荧光原位杂交(FISH) | 第133-134页 |
| 2 结果与分析 | 第134-142页 |
| ·工程菌株对两种农药的降解 | 第134-135页 |
| ·基因工程菌株的平板计数 | 第135-137页 |
| ·土壤总DNA的直接法和间接法提取 | 第137页 |
| ·土壤中特异基因的检测灵敏度分析 | 第137-138页 |
| ·环境释放区基因工程菌的MPN-PCR计数 | 第138-140页 |
| ·荧光原位杂交探针的特异性验证 | 第140-142页 |
| ·环境释放区中基因工程菌的FISH检测 | 第142页 |
| 3 讨论 | 第142-145页 |
| 本章小结 | 第145-146页 |
| 参考文献 | 第146-149页 |
| 第七章 工程菌释放对土壤微生物群落结构的影响研究 | 第149-160页 |
| 1 材料与方法 | 第149-151页 |
| ·培养基 | 第149页 |
| ·土壤中可培养细菌、放线菌和真菌的平板计数 | 第149页 |
| ·PCR-DGGE实验 | 第149-151页 |
| 2 结果与分析 | 第151-156页 |
| ·工程菌释放对土壤中可培养三大菌群数量的影响 | 第151-152页 |
| ·基于土壤总DNA的16S rDNA V3区的DGGE分析 | 第152-156页 |
| 3 讨论 | 第156-158页 |
| 本章小结 | 第158页 |
| 参考文献 | 第158-160页 |
| 全文总结 | 第160-162页 |
| 本论文研究的主要创新点 | 第162-163页 |
| 附录 | 第163-177页 |
| 附录1 实验用培养基及分子生物学试剂 | 第163-167页 |
| 附录2 转基因微生物环境释放相关资料 | 第167-169页 |
| 附录3 DGGE图谱聚类分析的相似性矩阵 | 第169-171页 |
| 附录4 相关载体序列 | 第171-177页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第177-179页 |
| 致谢 | 第179页 |
