| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第一部分 前言 | 第11-20页 |
| 一 利用酵母生产疫苗研究进展 | 第11-13页 |
| (一) 毕赤酵母表达系统的优点 | 第12-13页 |
| (二) 毕赤酵母表达系统的缺点 | 第13页 |
| 二 转基因植物口服疫苗研究进展 | 第13-18页 |
| (一) 利用转基因植物生产蛋白研究进展 | 第13-15页 |
| (二) 转基因植物疫苗在人体内免疫反应的途径 | 第15-16页 |
| (三) 转基因植物蛋白表达过程中存在的问题 | 第16-18页 |
| 1 转基因植物中蛋白表达量 | 第16-17页 |
| 2 抗原蛋白在转基因植物中的稳定性 | 第17页 |
| 3 口服免疫的免疫耐受性及其免疫记忆 | 第17页 |
| 4 转基因疫苗的安全性 | 第17-18页 |
| 三 该研究的目的、意义和内容 | 第18-20页 |
| (一) 研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| (二) 研究内容 | 第19-20页 |
| 第二部分 毕赤酵母表达乙肝表面抗原 | 第20-36页 |
| 一 实验材料 | 第20-22页 |
| (一) 质粒和菌株 | 第20页 |
| (二) 主要试剂 | 第20页 |
| (三) 主要仪器 | 第20页 |
| (四) 基本培养基 | 第20-22页 |
| 1 母液 | 第20-21页 |
| 2 培养基 | 第21-22页 |
| 二 实验方法 | 第22-28页 |
| (一) 目的基因获得 | 第22页 |
| (二) 大肠杆菌(E coli) DH5α感受态的制备 | 第22-23页 |
| (三) 质粒 DNA转化大肠杆菌 | 第23页 |
| (四) 酵母表达载体的构建 | 第23页 |
| (五) 酵母表达载体的线性化和纯化 | 第23-24页 |
| (六) LiCL方法制备酵母GS115感受态细胞及其转化 | 第24-25页 |
| 1 主要试剂 | 第24页 |
| 2 实验步骤 | 第24-25页 |
| (七) 毕赤酵母基因组的提取 | 第25-26页 |
| (八) 酵母转化子的PCR鉴定 | 第26页 |
| (九) 重组酵母的诱导表达及其表达蛋白提取 | 第26-27页 |
| (十) SDS-PAGE中蛋白银染 | 第27页 |
| 1 主要试剂 | 第27页 |
| 2 实验步骤 | 第27页 |
| (十一) ELISA检测 | 第27-28页 |
| 三 结果 | 第28-36页 |
| (一) 目的基因的获得及其克隆载体酶切 | 第28-29页 |
| (二) 目的基因的测序 | 第29-30页 |
| (三) 目的基因翻译序列分析 | 第30-31页 |
| (四) 酵母表达载体的酶切鉴定 | 第31-33页 |
| (五) 酵母转化子的PCR鉴定结果 | 第33-34页 |
| (六) 酵母诱导表达及其SDS-PAGE | 第34页 |
| (七) 目的蛋白ELISA检测 | 第34-36页 |
| 第三部分 葡萄愈伤组织表达乙肝表面抗原 | 第36-50页 |
| 一 试验材料 | 第36-37页 |
| (一) 植物材料 | 第36页 |
| (二) 质粒和菌株 | 第36页 |
| (三) 主要试剂 | 第36页 |
| (四) 主要仪器 | 第36页 |
| (五) 基本培养基 | 第36-37页 |
| 二 实验方法 | 第37-44页 |
| (一) 植物表达载体构建 | 第37页 |
| (二) 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第37页 |
| (三) 根癌农杆菌感受态细胞的转化 | 第37页 |
| (四) 根癌农杆菌质粒提取和鉴定 | 第37-38页 |
| (五) 根癌农杆菌的培养 | 第38-39页 |
| (六) 葡萄愈伤组织的诱导及预培养 | 第39页 |
| (七) 葡萄愈伤组织对潮霉素的敏感性试验 | 第39页 |
| (八) 根癌农杆菌与葡萄愈伤组织的共培养和选择培养 | 第39页 |
| (九) 用CTAB法提取葡萄愈伤组织总DNA | 第39-40页 |
| 1 主要试剂 | 第39-40页 |
| 2 实验步骤 | 第40页 |
| (十) 抗性愈伤组织 PCR鉴定 | 第40-41页 |
| (十一) 抗性愈伤组织 PCR-Southern杂交鉴定 | 第41-44页 |
| 1 PCR产物电泳及其变性 | 第41-42页 |
| 2 毛细管转移法转膜 | 第42页 |
| 3 探针制备 | 第42-43页 |
| 4 预杂交和杂交 | 第43页 |
| 5 严谨洗膜 | 第43页 |
| 6 底物孵育及其曝光 | 第43页 |
| 7 X光片显影 | 第43-44页 |
| 三 实验结果 | 第44-50页 |
| (一) 表达载体的构建和酶切鉴定 | 第44-46页 |
| (二) 葡萄愈伤组织筛选剂浓度的确立 | 第46-47页 |
| (三) 葡萄愈伤组织预培养时间对根癌农杆菌转化的影响 | 第47页 |
| (四) 甘露醇处理对根癌农杆菌转化的影响 | 第47-48页 |
| (五) 抗性葡萄愈伤组织的PCR鉴定结果 | 第48-49页 |
| (六) PCR-Southern杂交结果 | 第49-50页 |
| 第四部分 讨论 | 第50-55页 |
| (一) 关于酵母表达系统 | 第50页 |
| (二) 毕赤酵母表达蛋白的诱导 | 第50-51页 |
| (三) 毕赤酵母表达乙肝表面抗原的修饰 | 第51页 |
| (四) 关于农杆菌转化植物材料时植物表达载体的选择 | 第51-52页 |
| (五) 关于农杆菌转化的几个影响因素 | 第52-53页 |
| 1 农杆菌系的侵染能力 | 第52页 |
| 2 共培养中外界因素的影响 | 第52-53页 |
| 3 再生系统 | 第53页 |
| (六) 关于转基因植物组织的分子生物学鉴定 | 第53-55页 |
| 第五部分 小结 | 第55-56页 |
| 第六部分 参考文献 | 第56-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
