| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 主要符号表 | 第14-15页 |
| 第1章 引言 | 第15-30页 |
| 1.1 海洋中主要的病原微生物 | 第15-23页 |
| 1.1.1 海洋环境 | 第15页 |
| 1.1.2 海洋病原微生物的来源 | 第15-16页 |
| 1.1.3 海洋病原微生物的种类及危害 | 第16-19页 |
| 1.1.4 副溶血性弧菌研究进展 | 第19-21页 |
| 1.1.5 锯缘青蟹呼肠孤病毒研究进展 | 第21-23页 |
| 1.2 海洋病原微生物检测技术 | 第23-28页 |
| 1.2.1 免疫学方法 | 第23-25页 |
| 1.2.2 分子学方法 | 第25-28页 |
| 1.2.3 其他方法 | 第28页 |
| 1.3 本研究的目的与意义 | 第28-30页 |
| 第2章 CPA-核酸试纸条法快速检测副溶血性弧菌方法的建立 | 第30-57页 |
| 2.1 材料与方法 | 第33-41页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第33页 |
| 2.1.2 实验主要试剂 | 第33-34页 |
| 2.1.3 主要实验仪器表 | 第34-35页 |
| 2.1.4 主要试剂及培养基的配制 | 第35-36页 |
| 2.1.5 引物及探针的设计 | 第36页 |
| 2.1.6 副溶血性弧菌tlh基因重组克隆质粒的构建 | 第36-39页 |
| 2.1.7 CPA扩增引物和探针的可行性验证 | 第39页 |
| 2.1.8 CPA扩增产物的检测 | 第39-40页 |
| 2.1.9 CPA反应体系及反应条件的优化 | 第40-41页 |
| 2.1.10 CPA法检测特异性和灵敏度的确定 | 第41页 |
| 2.2 实验结果 | 第41-54页 |
| 2.2.1 副溶血性弧菌tlh基因片段阳性克隆质粒的构建及验证 | 第41-43页 |
| 2.2.2 副溶血性弧菌CPA法扩增体系的初步建立 | 第43-44页 |
| 2.2.3 反应体系的优化结果 | 第44-48页 |
| 2.2.4 CPA法检测副溶血性弧菌特异性分析 | 第48-49页 |
| 2.2.5 CPA法与传统PCR法检测灵敏度的比较 | 第49-54页 |
| 2.3 分析与讨论 | 第54-56页 |
| 2.4 结论 | 第56-57页 |
| 第3章 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12的原核表达及多克隆抗体的制备 | 第57-87页 |
| 3.1 材料与方法 | 第57-70页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第57-60页 |
| 3.1.2 引物设计 | 第60页 |
| 3.1.3 重组克隆质粒构建 | 第60-62页 |
| 3.1.4 青蟹呼长孤病毒VP12蛋白序列生物信息学分析 | 第62-63页 |
| 3.1.5 重组表达质粒的构建 | 第63-64页 |
| 3.1.6 重组蛋白的诱导表达、纯化及免疫印迹分析 | 第64-68页 |
| 3.1.7 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12多克隆抗体的制备 | 第68-70页 |
| 3.2 实验结果 | 第70-85页 |
| 3.2.1 重组克隆质粒的验证 | 第70页 |
| 3.2.2 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12结构特征 | 第70-77页 |
| 3.2.3 重组表达质粒的构建及验证 | 第77-78页 |
| 3.2.4 重组蛋白的诱导表达、纯化及免疫印迹分析 | 第78-83页 |
| 3.2.5 多克隆抗体的制备 | 第83-85页 |
| 3.3 讨论 | 第85-86页 |
| 3.4 结论 | 第86-87页 |
| 第4章 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12单克隆抗体的制备 | 第87-97页 |
| 4.1 实验材料与方法 | 第87-92页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第87-89页 |
| 4.1.2 小鼠免疫 | 第89页 |
| 4.1.3 细胞融合 | 第89-90页 |
| 4.1.4 阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆 | 第90页 |
| 4.1.5 杂交瘤细胞的冻存及复苏 | 第90页 |
| 4.1.6 腹水的制备 | 第90-91页 |
| 4.1.7 Dot blotting检测抗体灵敏度 | 第91页 |
| 4.1.8 腹水单克隆抗体的纯化 | 第91-92页 |
| 4.1.9 单克隆抗体亚类的鉴定 | 第92页 |
| 4.1.10 间接ELISA法测定单克隆抗体效价 | 第92页 |
| 4.1.11 单克隆抗体的Western blotting分析 | 第92页 |
| 4.2 实验结果 | 第92-96页 |
| 4.2.1 骨髓瘤细胞的准备 | 第92-93页 |
| 4.2.2 融合细胞的鉴定 | 第93页 |
| 4.2.3 Dot blotting分析 | 第93页 |
| 4.2.4 单克隆抗体 1M9和 2N5纯化效果的SDS-PAGE电泳分析 | 第93-94页 |
| 4.2.5 单克隆抗体亚类的鉴定 | 第94-95页 |
| 4.2.6 抗体效价的测定 | 第95页 |
| 4.2.7 抗体的Western blotting分析 | 第95-96页 |
| 4.3 分析与讨论 | 第96页 |
| 4.4 小结 | 第96-97页 |
| 第5章 免疫胶体金试纸条检测方法的建立 | 第97-113页 |
| 5.1 实验材料与方法 | 第98-105页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第98-99页 |
| 5.1.2 胶体金颗粒的制备 | 第99-100页 |
| 5.1.3 胶体金与金标抗体最佳标记条件的确定 | 第100-102页 |
| 5.1.4 胶体金探针的制备及纯化 | 第102页 |
| 5.1.5 金标垫的预处理 | 第102-103页 |
| 5.1.6 金标垫、检测线、质控线上抗体最佳喷涂量的确定 | 第103页 |
| 5.1.7 封闭液的确定 | 第103页 |
| 5.1.8 试纸条的组装 | 第103-104页 |
| 5.1.9 试纸条的使用方法及结果判读 | 第104页 |
| 5.1.10 试纸条检测灵敏度确定 | 第104页 |
| 5.1.11 试纸条检测特异性验证 | 第104-105页 |
| 5.2 结果分析 | 第105-110页 |
| 5.2.1 胶体金质量的鉴定 | 第105-106页 |
| 5.2.2 单克隆抗体与胶体金标记的最佳pH | 第106-107页 |
| 5.2.3 单克隆抗体与胶体金标记最低标记量 | 第107-108页 |
| 5.2.4 金标垫处理液的选择 | 第108页 |
| 5.2.5 金标抗体稀释浓度 | 第108-109页 |
| 5.2.6 NC膜封闭液的优化 | 第109页 |
| 5.2.7 NC膜上最低抗体包被浓度的确定 | 第109页 |
| 5.2.8 试纸条灵敏度的验证 | 第109-110页 |
| 5.2.9 试纸条特异性的验证 | 第110页 |
| 5.3 分析与讨论 | 第110-112页 |
| 5.4 结论 | 第112-113页 |
| 第6章 结论与展望 | 第113-115页 |
| 6.1 本论文的主要结论 | 第113页 |
| 6.2 本论文的主要创新点 | 第113-114页 |
| 6.3 本论文的研究展望 | 第114-115页 |
| 致谢 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-125页 |
| 附录 | 第125-128页 |
| 在学期间发表的学术论文 | 第128页 |
