| 符号说明 | 第4-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| Abstract | 第13-14页 |
| 1 前言 | 第16-24页 |
| 1.1 硫氧还蛋白过氧化物酶 | 第18-19页 |
| 1.1.1 硫氧还蛋白过氧化物酶的结构特点 | 第18页 |
| 1.1.2 硫氧还蛋白过氧化物酶的功能 | 第18页 |
| 1.1.3 硫氧还蛋白过氧化物酶3 | 第18-19页 |
| 1.2 硫氧还蛋白 | 第19-21页 |
| 1.2.1 硫氧还蛋白的结构特点 | 第19-20页 |
| 1.2.2 硫氧还蛋白的功能 | 第20页 |
| 1.2.3 硫氧还蛋白1 | 第20页 |
| 1.2.4 硫氧还蛋白2 | 第20-21页 |
| 1.3 谷氧还蛋白 | 第21-22页 |
| 1.3.1 谷氧还蛋白分类与结构特点 | 第21页 |
| 1.3.2 谷氧还蛋白的功能 | 第21-22页 |
| 1.3.3 谷氧还蛋白1 | 第22页 |
| 1.3.4 谷氧还蛋白2 | 第22页 |
| 1.4 本研究的目的及意义 | 第22-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-29页 |
| 2.1.1 蜜蜂材料 | 第24页 |
| 2.1.2 中华蜜蜂的饲养与处理 | 第24-25页 |
| 2.1.3 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.1.4 酶与各种生化试剂 | 第25页 |
| 2.1.5 PCR引物 | 第25-29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-50页 |
| 2.2.1 中华蜜蜂总RNA的提取 | 第29-30页 |
| 2.2.1.1 利用Trizol试剂提取总RNA | 第29页 |
| 2.2.1.2 去除总RNA样品中的基因组DNA | 第29页 |
| 2.2.1.3 琼脂糖甲醛变性凝胶进行RNA电泳 | 第29-30页 |
| 2.2.2 cDNA第一链的合成 | 第30页 |
| 2.2.3 cDNA纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.4 cDNA末端加尾反应(5'末端) | 第31页 |
| 2.2.5 中华蜜蜂AccGrx1基因cDNA全长序列获得 | 第31-36页 |
| 2.2.5.1 AccGrx1基因中间片段的获得 | 第31-33页 |
| 2.2.5.2 RACE法获得AccGrx1基因5'端序列 | 第33-34页 |
| 2.2.5.3 RACE法AccGrx1基因3'端序列 | 第34-35页 |
| 2.2.5.4 AccGrx1基因全长cDNA序列的获得 | 第35-36页 |
| 2.2.6 目的片段回收、与克隆载体连接 | 第36页 |
| 2.2.6.1 目的片段回收 | 第36页 |
| 2.2.6.2 目的片段与克隆载体的连接 | 第36页 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 | 第36-37页 |
| 2.2.8 大肠杆菌质粒DNA的提取及酶切鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.8.1 试剂盒法微量提取质粒 | 第37-38页 |
| 2.2.8.2 重组质粒的酶切鉴定 | 第38页 |
| 2.2.9 目的基因DNA序列测定 | 第38页 |
| 2.2.10 中华蜜蜂目的基因基因组全长序列的获得 | 第38-39页 |
| 2.2.10.1 EasyPure~(TM) Genomic DNA试剂盒提取基因组DNA | 第38-39页 |
| 2.2.10.2 中华蜜蜂AccGrx1基因基因组全长序列获得 | 第39页 |
| 2.2.11 实时荧光定量PCR检测目的基因表达情况 | 第39-40页 |
| 2.2.11.1 实时荧光定量PCR反应体系及反应条件 | 第39-40页 |
| 2.2.11.2 数据处理 | 第40页 |
| 2.2.12 原核表达载体构建,重组蛋白诱导表达与纯化 | 第40-41页 |
| 2.2.12.1 原核表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.2.12.2 重组蛋白诱导表达 | 第41页 |
| 2.2.12.3 重组蛋白纯化 | 第41页 |
| 2.2.13 AccTrx2酶活力测定 | 第41-42页 |
| 2.2.14 纸片扩散方法检测重组AccTpx-3功能 | 第42页 |
| 2.2.15 混合功能氧化系统(MFO系统)检测纯化蛋白功能 | 第42页 |
| 2.2.16 合成双链RNA(dsRNA)干扰AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1 | 第42-44页 |
| 2.2.16.1 制备dsRNA模板 | 第42页 |
| 2.2.16.2 合成AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1基因dsRNA | 第42-43页 |
| 2.2.16.3 饲喂dsRNA干扰基因AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1 | 第43-44页 |
| 2.2.17 检测RNA干扰中华蜜蜂目的基因的效果 | 第44页 |
| 2.2.18 检测RNA干扰样品中的抗氧化酶活性 | 第44-45页 |
| 2.2.18.1 检测RNA干扰样品的过氧化氢酶活性 | 第44页 |
| 2.2.18.2 检测RNA干扰样品的过氧化物酶活性 | 第44-45页 |
| 2.2.19 检测RNA干扰样品中的代谢产物含量 | 第45-49页 |
| 2.2.19.1 检测RNA干扰样品中过氧化氢含量 | 第45-46页 |
| 2.2.19.2 检测RNA干扰样品中蛋白质羰基含量 | 第46页 |
| 2.2.19.3 检测RNA干扰样品中维生素C含量 | 第46-47页 |
| 2.2.19.4 检测RNA干扰样品中GSH/GSSG比率 | 第47-49页 |
| 2.2.19.5 检测RNA干扰样品中NADP~+/NADPH比率 | 第49页 |
| 2.2.20 AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1基因沉默后检测其他抗氧化相关基因表达水平 | 第49-50页 |
| 3 结果与分析 | 第50-77页 |
| 3.1 AccTpx-3基因的克隆及功能分析 | 第50-57页 |
| 3.1.1 AccTpx-3基因全长cDNA序列的分离 | 第50页 |
| 3.1.2 AccTpx-3基因全长cDNA序列分析 | 第50-51页 |
| 3.1.3 AccTpx-3基因组结构分析 | 第51-52页 |
| 3.1.4 中华蜜蜂AccTpx-3基因表达特性分析 | 第52-55页 |
| 3.1.4.1 中华蜜蜂AccTpx-3基因在不同发育时期及不同组织部位表达分析 | 第52-53页 |
| 3.1.4.2 中华蜜蜂AccTpx-3基因在不同应激条件下表达分析 | 第53-55页 |
| 3.1.5 AccTpx-3原核表达纯化及重组蛋白功能分析 | 第55-57页 |
| 3.1.5.1 AccTpx-3原核诱导表达及纯化 | 第55页 |
| 3.1.5.2 纸片扩散法分析重组蛋白功能 | 第55-56页 |
| 3.1.5.3 MFO系统分析AccTpx-3纯化蛋白抗氧化功能 | 第56-57页 |
| 3.2 AccTrx2基因的克隆及功能分析 | 第57-65页 |
| 3.2.1 AccTrx2基因全长cDNA序列的获得 | 第57页 |
| 3.2.2 AccTrx2基因全长cDNA序列分析 | 第57-59页 |
| 3.2.3 AccTrx2基因组结构分析 | 第59-60页 |
| 3.2.4 中华蜜蜂AccTrx2基因表达特性分析 | 第60-63页 |
| 3.2.4.1 中华蜜蜂AccTrx2基因在不同发育时期及不同组织部位表达分析 | 第60-61页 |
| 3.2.4.2 中华蜜蜂AccTrx2基因在多种氧化压力条件下的表达分析 | 第61-63页 |
| 3.2.5 AccTrx2原核表达纯化、酶活力测定及功能分析 | 第63-65页 |
| 3.2.5.1 AccTrx2原核表达及纯化 | 第63页 |
| 3.2.5.2 AccTrx2酶活力测定 | 第63-64页 |
| 3.2.5.3 AccTrx2抗氧化功能分析 | 第64-65页 |
| 3.3 AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1基因克隆及功能分析 | 第65-77页 |
| 3.3.1 AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1基因全长cDNA序列的获得 | 第65页 |
| 3.3.2 AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1基因cDNA序列分析 | 第65-69页 |
| 3.3.3 AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1基因组结构分析 | 第69-70页 |
| 3.3.4 AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1基因表达特性分析 | 第70-73页 |
| 3.3.4.1 AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1基因在不同发育时期及不同组织部位表达分析 | 第70页 |
| 3.3.4.2 AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1基因在多种氧化压力条件下的表达分析 | 第70-73页 |
| 3.3.5 利用RNAi技术对AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1基因进行干扰 | 第73页 |
| 3.3.6 RNA干扰后检测相关抗氧化酶活性和抗氧化代谢产物含量 | 第73-74页 |
| 3.3.6.1 RNA干扰后检测CAT和POD酶活性 | 第73-74页 |
| 3.3.6.2 RNA干扰后检测抗氧化代谢产物含量 | 第74页 |
| 3.3.7 RNA干扰后检测其他抗氧化相关基因的表达水平 | 第74-77页 |
| 4 讨论 | 第77-84页 |
| 4.1 AccTpx-3基因研究结果讨论 | 第77-79页 |
| 4.1.1 AccTpx-3基因序列分析 | 第77页 |
| 4.1.2 AccTpx-3基因表达特性分析 | 第77-78页 |
| 4.1.3 AccTpx-3功能分析 | 第78-79页 |
| 4.2 AccTrx2基因研究结果讨论 | 第79-80页 |
| 4.2.1 AccTrx2基因序列分析 | 第79页 |
| 4.2.2 AccTrx2基因表达特性分析 | 第79-80页 |
| 4.2.3 AccTrx2功能分析 | 第80页 |
| 4.3 AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1基因研究结果讨论 | 第80-84页 |
| 4.3.1 AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1基因序列分析 | 第80页 |
| 4.3.2 AccGrx1、AccGrx2和AccTrx1基因表达特性分析 | 第80-81页 |
| 4.3.3 AccGrx1、AccGrx2、AccTpx-3和AccTrx1功能分析 | 第81-84页 |
| 5 小结 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-94页 |
| 本论文研究课题来源 | 第94-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第96页 |
