| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-9页 |
| 主要符号表 | 第14-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-35页 |
| 1.1 中国农药使用现状 | 第15-19页 |
| 1.1.1 农药的概述 | 第15页 |
| 1.1.2 农药的使用现状 | 第15-17页 |
| 1.1.3 有机磷农药的概况 | 第17-18页 |
| 1.1.4 有机磷农药中毒机理 | 第18-19页 |
| 1.2 有机磷水解酶研究进展 | 第19-23页 |
| 1.2.1 有机磷水解酶及其性质 | 第19页 |
| 1.2.2 有机磷水解酶的研究进展 | 第19-22页 |
| 1.2.3 有机磷水解酶的应用 | 第22页 |
| 1.2.4 有机磷农药的深度降解 | 第22-23页 |
| 1.3 表达系统的选择 | 第23-27页 |
| 1.3.1 常用的表达系统概述 | 第23-24页 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 | 第24页 |
| 1.3.3 毕赤酵母表达菌株 | 第24-25页 |
| 1.3.4 外源基因的整合方式 | 第25-26页 |
| 1.3.5 毕赤酵母表达载体 | 第26-27页 |
| 1.3.6 毕赤酵母转化和筛选 | 第27页 |
| 1.4 提高重组蛋白表达量的策略 | 第27-32页 |
| 1.4.1 培养条件的优化 | 第28-30页 |
| 1.4.2 在细胞水平上 | 第30页 |
| 1.4.3 在分子水平上 | 第30-32页 |
| 1.5 荧光定量PCR | 第32-33页 |
| 1.5.1 荧光定量PCR技术及其原理 | 第32-33页 |
| 1.5.2 荧光定量PCR的应用 | 第33页 |
| 1.6 本文的研究目的与意义 | 第33-35页 |
| 第2章 材料与方法 | 第35-54页 |
| 2.1 材料 | 第35-39页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第35-36页 |
| 2.1.2 药品试剂 | 第36页 |
| 2.1.3 培养基配方 | 第36-37页 |
| 2.1.4 实验仪器与相关设备 | 第37-38页 |
| 2.1.5 实验中主要缓冲液配方 | 第38-39页 |
| 2.2 实验方法 | 第39-54页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第39-40页 |
| 2.2.2 部分重叠PCR的方法合成OphcM基因 | 第40-41页 |
| 2.2.3 纯化PCR产物 | 第41-42页 |
| 2.2.4 用T4 DNA聚合酶处理回收片段 | 第42页 |
| 2.2.5 酶介导的连接反应 | 第42-43页 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备 | 第43-44页 |
| 2.2.7 转化方法 | 第44页 |
| 2.2.8 碱裂解法提取质粒DNA | 第44-45页 |
| 2.2.9 表达载体的构建 | 第45-46页 |
| 2.2.10 外源基因在毕赤酵母中的表达 | 第46-47页 |
| 2.2.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白 | 第47-48页 |
| 2.2.12 蛋白浓度的测定 | 第48页 |
| 2.2.13 有机磷水解酶酶活测定方法 | 第48-49页 |
| 2.2.14 有机磷水解酶酶学性质分析 | 第49-50页 |
| 2.2.15 蛋白质的纯化 | 第50页 |
| 2.2.16 实时荧光定量PCR | 第50-52页 |
| 2.2.17 有机磷水解酶在发酵罐中表达 | 第52-54页 |
| 第3章 结果与分析 | 第54-71页 |
| 3.1 表达载体的构建 | 第54-56页 |
| 3.1.1 有机磷水解酶基因的优化 | 第54-55页 |
| 3.1.2 有机磷水解酶基因的合成 | 第55页 |
| 3.1.3 表达载体的构建 | 第55-56页 |
| 3.2 有机磷水解酶在毕赤酵母中的表达 | 第56-58页 |
| 3.2.1 毕赤酵母的转化 | 第56页 |
| 3.2.2 毕赤酵母在摇瓶中的表达 | 第56-57页 |
| 3.2.3 拷贝数对表达量的影响 | 第57页 |
| 3.2.4 拷贝数对酶活性的影响 | 第57-58页 |
| 3.3 不同拷贝数菌株的表达差异分析 | 第58-63页 |
| 3.3.1 RNA的提取及检测分析 | 第58-59页 |
| 3.3.2 荧光定量PCR引物的特异性分析 | 第59-60页 |
| 3.3.3 实时荧光定量PCR扩增曲线 | 第60-61页 |
| 3.3.4 重组菌株拷贝数的验证 | 第61-62页 |
| 3.3.5 不同拷贝数菌株的表达差异的相对定量分析 | 第62-63页 |
| 3.4 重组有机磷水解酶OPHCM酶学性质分析 | 第63-69页 |
| 3.4.1 OPHCM的分离纯化 | 第63-64页 |
| 3.4.2 温度对OPHCM活性的影响 | 第64-65页 |
| 3.4.3 pH对OPHCM活性的影响 | 第65页 |
| 3.4.4 不同添加物对OPHCM活性的影响 | 第65-68页 |
| 3.4.5 有机磷水解酶OPHCM的糖基化分析 | 第68-69页 |
| 3.5 重组有机磷水解酶OPHCM高密度发酵 | 第69-71页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第71-74页 |
| 4.1 讨论 | 第71-73页 |
| 4.2 展望 | 第73-74页 |
| 结论 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 附录 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82页 |