| 中文摘要 | 第7-11页 |
| 英文摘要 | 第11-17页 |
| 符号说明 | 第18-20页 |
| 前言 | 第20-24页 |
| 技术路线 | 第24-25页 |
| 第一部分 hTERT启动子调控的canstatin基因表达载体的构建及其体外活性检测 | 第25-49页 |
| 材料与方法 | 第25-41页 |
| 1.材料 | 第25-29页 |
| 1.1 质粒、菌株与细胞株 | 第25页 |
| 1.2 主要试剂 | 第25-26页 |
| 1.3 一般试剂 | 第26-28页 |
| 1.4 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.方法 | 第29-41页 |
| 2.1 分泌型真核表达载体phtert-canstatin的构建及鉴定 | 第29-34页 |
| 2.1.1 质粒phTERTluc1和pETC的扩增与提取 | 第29-30页 |
| 2.1.2 PCR扩增目的片断canstatin及回收纯化 | 第30-31页 |
| 2.1.3 目的片段canstatin及表达载体的双酶切回收 | 第31-32页 |
| 2.1.4 目的片段与表达载体的连接与转化 | 第32-33页 |
| 2.1.5 阳性重组子的筛选鉴定 | 第33-34页 |
| 2.1.6 阳性重组子DNA的扩增、提取与纯化 | 第34页 |
| 2.2 hTERT启动子调控的canstatin基因靶向MCF-7／ADR细胞表达的检测 | 第34-40页 |
| 2.2.1 细胞的培养、冻存和复苏 | 第34-35页 |
| 2.2.2 脂质体转染 | 第35-36页 |
| 2.2.3 半定量RT-PCR检测各组细胞canstatin mRNA水平的表达 | 第36-38页 |
| 2.2.4 蛋白质印迹检测canstatin蛋白水平的表达 | 第38-40页 |
| 2.3 hTERT启动子调控的canstatin基因诱导ECV204细胞凋亡的检测 | 第40-41页 |
| 2.3.1 四甲基偶氮唑盐(MTT)法 | 第40页 |
| 2.3.2 形态学观察 | 第40-41页 |
| 2.3.3 PI染色法 | 第41页 |
| 2.3.4 AnnexinV-FITC／PI法 | 第41页 |
| 结果 | 第41-44页 |
| 1.hTERT启动子调控的canstatin基因表达载体phtert-canstatin的构建 | 第41-42页 |
| 1.1 重组载体构建流程图 | 第41页 |
| 1.2 阳性重组子的筛选与鉴定 | 第41-42页 |
| 1.2.1 PCR鉴定重组载体 | 第41-42页 |
| 1.2.2 阳性重组子的酶切筛选 | 第42页 |
| 1.2.3 DNA测序及序列分析 | 第42页 |
| 2.Canstatin基因表达的检测 | 第42页 |
| 2.1 半定量RT-PCR检测canstatin mRNA水平的表达 | 第42页 |
| 2.2 蛋白质印迹检测canstatin蛋白水平的表达 | 第42页 |
| 3.Canstatin基因诱导ECV204细胞凋亡情况的检测 | 第42-44页 |
| 3.1 MTT法检测canstatin对ECV204细胞的抑制作用 | 第42-43页 |
| 3.2 光镜下观察ECV204细胞形态学变化 | 第43页 |
| 3.3 FCM的Annexin V-FITC／PI双标法检测canstatin诱导的早期凋亡 | 第43页 |
| 3.4 FCM的PI染色法检测canstatin诱导的凋亡 | 第43-44页 |
| 讨论 | 第44-49页 |
| 第二部分 hTERT启动子调控的canstatin基因联合TRAIL基因治疗人乳腺癌裸鼠移植瘤的实验研究 | 第49-63页 |
| 材料与方法 | 第49-54页 |
| 1.材料 | 第49页 |
| 1.1 实验动物、质粒和细胞株 | 第49页 |
| 1.2 主要试剂、仪器 | 第49页 |
| 2.方法 | 第49-53页 |
| 2.1 试剂盒大量提取纯化的质粒DNA | 第49-50页 |
| 2.2 细胞培养及收集 | 第50页 |
| 2.3 人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型的制备及实验分组 | 第50页 |
| 2.4 观察指标 | 第50-53页 |
| 2.4.1 重组表达载体对肿瘤体积的影响 | 第51页 |
| 2.4.2 半定量RT-PCR检测各组肿瘤canstatin、TRAIL mRNA水平的表达 | 第51页 |
| 2.4.3 蛋白质印迹检测canstatin、TRAIL蛋白水平的表达 | 第51-52页 |
| 2.4.4 病理学检查 | 第52页 |
| 2.4.5 免疫组织化学检查(SABC法) | 第52-53页 |
| 2.4.6 原位细胞凋亡的检测(TUNEL法) | 第53页 |
| 2.4.7 凋亡分析 | 第53页 |
| 3.统计分析 | 第53-54页 |
| 结果 | 第54-56页 |
| 1.重组表达载体治疗后对肿瘤体积的影响 | 第54页 |
| 2.半定量RT-PCR检测各组肿瘤canstatin、TRAIL mRNA水平的表达 | 第54页 |
| 3.蛋白质印迹检测canstatin、TRAIL蛋白水平的表达 | 第54页 |
| 4.病理学检查 | 第54页 |
| 5.免疫组织化学结果 | 第54-55页 |
| 5.1 各组肿瘤canstatin、TRAIL基因的表达 | 第54-55页 |
| 5.2 微血管密度(MVD) | 第55页 |
| 6.原位细胞凋亡的检测(TUNEL法) | 第55页 |
| 7.凋亡分析 | 第55-56页 |
| 讨论 | 第56-63页 |
| 小结 | 第63-64页 |
| 附图 | 第64-78页 |
| 参考文献 | 第78-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及编著目录 | 第85-86页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第86页 |
