| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 综述 | 第12-26页 |
| 1.1 表观遗传学 | 第12-13页 |
| 1.2 DNA甲基化 | 第13-22页 |
| 1.2.1 DNA甲基化与CpG岛 | 第13-14页 |
| 1.2.2 DNA甲基转移酶 | 第14-17页 |
| 1.2.2.1 DNMT1 | 第15页 |
| 1.2.2.2 DNMT3家族成员 | 第15-17页 |
| 1.2.3 DNA甲基化的生物学功能 | 第17-21页 |
| 1.2.3.1 DNA甲基化与基因表达 | 第17-18页 |
| 1.2.3.2 DNA甲基化与胚胎发育 | 第18-19页 |
| 1.2.3.3 DNA甲基化与肿瘤发生 | 第19-21页 |
| 1.2.3.3.1 肿瘤细胞的高甲基化 | 第20-21页 |
| 1.2.3.3.2 肿瘤细胞的低甲基化 | 第21页 |
| 1.2.4 DNA甲基化与去甲基化 | 第21-22页 |
| 1.3 UHRF1和UHRF2研究概况 | 第22-26页 |
| 1.3.1 UHRF1研究概况 | 第22-24页 |
| 1.3.1.1 UHRF1 | 第22-24页 |
| 1.3.1.2 UHRF1与癌症发生 | 第24页 |
| 1.3.2 UHRF2研究概况 | 第24-26页 |
| 1.3.2.1 UHRF2 | 第24-26页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第26-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-34页 |
| 2.1.1 质粒 | 第26页 |
| 2.1.2 抗体 | 第26页 |
| 2.1.3 细胞 | 第26-27页 |
| 2.1.4 实验试剂或试剂盒 | 第27-28页 |
| 2.1.5 实验常用仪器 | 第28-29页 |
| 2.1.6 溶液配制 | 第29-34页 |
| 2.1.6.0 细菌培养相关溶液配制 | 第29-30页 |
| 2.1.6.1 细胞培养相关溶液配制 | 第30页 |
| 2.1.6.2 与DNA相关溶液配制 | 第30页 |
| 2.1.6.3 与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液配制 | 第30-31页 |
| 2.1.6.4 考马斯亮蓝考染液和脱色液配制 | 第31-32页 |
| 2.1.6.5 与Western Blotting相关溶液配制 | 第32-33页 |
| 2.1.6.6 与免疫沉淀相关溶液配制 | 第33页 |
| 2.1.6.7 与GST-pull down相关溶液配制 | 第33-34页 |
| 2.2 实验方法 | 第34-50页 |
| 2.2.0 分子克隆 | 第34-36页 |
| 2.2.1 定点突变 | 第36-37页 |
| 2.2.2 GST融合蛋白的表达与纯化 | 第37-38页 |
| 2.2.2.1 GST融合蛋白表达 | 第37页 |
| 2.2.2.2 GST融合蛋白纯化 | 第37-38页 |
| 2.2.3 His-融合蛋白的表达与纯化 | 第38-40页 |
| 2.2.3.1 His-融合蛋白表达 | 第38-39页 |
| 2.2.3.2 His融合蛋白纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.4 GST pull-down实验 | 第40页 |
| 2.2.5 体外泛素化实验 | 第40页 |
| 2.2.6 细胞复苏 | 第40-41页 |
| 2.2.7 细胞培养 | 第41页 |
| 2.2.8 细胞传代 | 第41-42页 |
| 2.2.9 细胞冻存 | 第42页 |
| 2.2.10 细胞转染 | 第42-43页 |
| 2.2.11 稳定细胞株的建立 | 第43-44页 |
| 2.2.11.1 建立目的蛋白稳定表达细胞株 | 第43页 |
| 2.2.11.2 建立shRNA稳定细胞株 | 第43-44页 |
| 2.2.12 应用细胞流式仪分析细胞周期 | 第44页 |
| 2.2.13 细胞增殖测定(MTS法) | 第44-45页 |
| 2.2.14 SDS-PAGE | 第45-48页 |
| 2.2.14.1 十二烷基硫酸钠/—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的配制 | 第45页 |
| 2.2.14.2 蛋白样品处理 | 第45页 |
| 2.2.14.3 电泳跑胶 | 第45-46页 |
| 2.2.14.4 考马斯亮蓝染色实验 | 第46页 |
| 2.2.14.5 蛋白质印迹实验 | 第46-48页 |
| 2.2.15 免疫染色 | 第48-49页 |
| 2.2.16 免疫沉淀(IP) | 第49-50页 |
| 第三章 UHRF2对DNA甲基化的调控机制及功能研究 | 第50-71页 |
| 3.1 引言 | 第50页 |
| 3.2 实验结果 | 第50-59页 |
| 3.2.1 UHRF2在DNA甲基化中的作用 | 第50-53页 |
| 3.2.1.1 UHRF2负调控DNA甲基化 | 第50-52页 |
| 3.2.1.2 UHRF2在蛋白水平负调控DNMT3A | 第52页 |
| 3.2.1.3 小结 | 第52-53页 |
| 3.2.2 在细胞内UHRF2能够介导DNMT3A的泛素化 | 第53-55页 |
| 3.2.2.1 泛素化修饰 | 第53页 |
| 3.2.2.2 在细胞内UHRF2能够促进DNMT3A的泛素化 | 第53-54页 |
| 3.2.2.3 小结 | 第54-55页 |
| 3.2.3 在体外UHRF2能够泛素化DNMT3A | 第55-59页 |
| 3.2.3.1 UHRF2能够与UBCH5c相互作用 | 第55-57页 |
| 3.2.3.2 UBE1、UBCH5c活性检测 | 第57-58页 |
| 3.2.3.3 UHRF2对DNMT3A的体外泛素化 | 第58页 |
| 3.2.3.4 小结 | 第58-59页 |
| 3.3 UHRF2与肿瘤的关系 | 第59-68页 |
| 3.3.1 UHRF1、UHRF2在肺癌细胞中通过调控DNMT3A蛋白水平负调控DNA甲基化 | 第60-62页 |
| 3.3.2 UHRF2在肿瘤发生中的作用 | 第62-67页 |
| 3.3.2.1 UHRF2蛋白水平降低抑制A549细胞的成瘤 | 第62页 |
| 3.3.2.2 过表达野生型DNMT3A抑制A549细胞的成瘤 | 第62-67页 |
| 3.3.2.2.1 在A549细胞中建立DNMT3A、DNMT3A R882C突变体的过表达稳系 | 第62-63页 |
| 3.3.2.2.2 过表达DNMT3A抑制A549细胞的增殖 | 第63-65页 |
| 3.3.2.2.3 在A549细胞中过表达野生型DNMT3A会抑制细胞的成瘤 | 第65-67页 |
| 3.3.3 小结 | 第67-68页 |
| 3.4 总结与讨论 | 第68-71页 |
| 3.4.1 UHRF2对起始性DNA甲基化起着负调控的作用 | 第68页 |
| 3.4.2 UHRF2通过介导DNMT3A的泛素化在蛋白水平负调控DNMT3A | 第68-69页 |
| 3.4.3 knock down UHRF2会抑制A549的增殖与细胞成瘤 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
