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隐地疫霉(Phytophthora cryptogea) Cryptogein基因的克隆及其功能的研究

致谢第4-16页
中文摘要第16-18页
英文摘要第18页
第一部分 文献综述第21-70页
    第一章 植物病原菌激发子与抗病防卫反应第22-43页
        1 引言第22页
        2 激发子的种类和性质第22-26页
            2.1 寡糖第23-24页
                2.1.1 寡聚半乳糖醛酸第23页
                2.1.2 几丁质及其衍生物第23页
                2.1.3 葡聚糖第23-24页
                2.1.4 脂多糖第24页
            2.2 糖蛋白第24-25页
                2.2.1 疫霉糖蛋白第24页
                2.2.2 酵母糖蛋白第24-25页
                2.2.3 锈菌糖蛋白第25页
            2.3 多肽和蛋白质第25-26页
                2.3.1 激发素第25页
                2.3.2 harpins第25-26页
                2.3.3 无毒蛋白第26页
                2.3.4 鞭毛蛋白第26页
                2.3.5 病毒蛋白第26页
                2.3.6 其它蛋白第26页
        3 病菌激发子—受体识别机制第26-29页
            3.1 激发子受体第26-27页
            3.2 病原激发子—受体识别第27-28页
            3.3 “保卫假说”第28-29页
        4 信号识别、传导、防卫反应产生过程中植物与动物的相似性第29-31页
            4.1 受体蛋白的结构第29-30页
            4.2 磷酸化与脱磷酸化第30页
            4.3 其它调控分子第30-31页
        5 激发子诱导的抗病防卫反应基因表达的调控第31-35页
            5.1 顺式作用元件的调控第32-33页
                5.1.1 GCC盒第32页
                5.1.2 As-1第32-33页
                5.1.3 W盒第33页
                5.1.4 G盒和H盒第33页
            5.2 转录因子表达的调控和活性的调节第33-35页
                5.2.1 转录调控第33-34页
                5.2.2 细胞核定位第34页
                5.2.3 转录因子修饰第34页
                5.2.4 转录因子间互作第34-35页
        参考文献第35-43页
    第二章 激发素(elicitins)研究进展第43-70页
        1 引言第43页
        2 elicitins的发现第43-44页
        3 elicitins的基本结构和理化性质第44-47页
            3.1 elicitins的一级结构第44-46页
            3.2 elicitins的高级结构第46-47页
            3.3 elicitins的理化性质第47页
        4 elicitins的生物学作用第47-50页
            4.1 elicitins与HR反应第47-48页
            4.2 α、β-elicitins诱导烟草HR反应差异的几种解释第48-49页
                4.2.1 移动性第48页
                4.2.2 与烟草细胞膜的受体亲和力和结合位点数目第48-49页
                4.2.3 与elicitins所带的净电荷第49页
            4.3 elicitins诱导的抗病性(SAR)和基因工程第49-50页
                4.3.1 用elicitins蛋白直接处理诱导的抗病性第49-50页
                4.3.2 elicitins基因转化产生的抗病性第50页
        5 elicitins诱导的防卫信号传导第50-53页
            5.1 elicitins的受体第50-51页
            5.2 elicitins引发的防卫信号传导第51-53页
        6 elicitins诱导HR和SAR的寄主专化性第53-54页
            6.1 elicitins具有寄主专化性第53-54页
            6.2 elicitins寄主专化性不强第54页
        7 elicitins在疫霉菌致病性和生活史中的作用第54-56页
        8 elicitins的基因结构第56-57页
        9 elicitins蛋白诱导HR的关键氨基酸位点第57-58页
        10 疫霉菌与植物的共进化—防御与反防御反应的统一第58-60页
        参考文献第60-70页
第二部分 实验研究第70-170页
    前言第71-73页
    第三章 隐地蛋白(Cryptogein)基因的克隆、定点突变及其植物双元表达载体的构建第73-99页
        1 材料与方法第73-85页
            1.1 材料第73-74页
                1.1.1 菌种、质粒第73页
                1.1.2 酶、化学试剂第73页
                1.1.3 抗生素第73-74页
                1.1.4 常用试剂的配制第74页
            1.2 方法第74-85页
                1.2.1 DNA分子操作常规技术第74-79页
                    1.2.1.1 PCR产物的纯化第74页
                    1.2.1.2 酶切产物(或PCR产物)割胶回收与纯化第74-75页
                    1.2.1.3 PCR扩增产物的克隆第75页
                    1.2.1.4 载体和目的基因片段的限制性内切酶酶切第75-76页
                    1.2.1.5 载体和目的基因片段的连接第76页
                    1.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌DH5α第76-77页
                        1.2.1.6.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备第76-77页
                        1.2.1.6.2 转化第77页
                    1.2.1.7 重组克隆的筛选与鉴定第77-79页
                        1.2.1.7.1 重组质粒的提取(CTAB法)第77-78页
                        1.2.1.7.2 重组质粒的试剂盒提取(用UMIQ-10柱离心式质粒小量抽提试剂盒Sangon公司)第78页
                        1.2.1.7.3 重组质粒的试剂盒提取(用QIAprep Spinminiprep Kit, Qiagen公司)第78-79页
                        1.2.1.7.4 重组质粒的PCR鉴定第79页
                        1.2.1.7.5 重组质粒的酶切鉴定第79页
                    1.2.1.8 DNA序列测定及分析第79页
                1.2.2 植物双元表达载体的构建第79-84页
                    1.2.2.1 目的基因的获得第79-82页
                        1.2.2.1.1 Cryptogein基因的克隆第79-81页
                        1.2.2.1.2 Cryptogein基因的PCR定点突变(pUC-CryK13V)第81-82页
                        1.2.2.1.3 烟草病程相关蛋白信号肽(PRs)基因的克隆第82页
                        1.2.2.1.4 PAL启动子和35S启动子的获得第82页
                    1.2.2.2 Crypt和CryK13V基因植物双元表达载体的构建策略第82-83页
                    1.2.2.3 Crypt和CryK13V基因植物双元表达载体结构的设计第83页
                        1.2.2.3.1 Crypt基因第83页
                        1.2.2.3.2 CryK13V基因第83页
                    1.2.2.4 Crypt基因和CryK13V基因植物双元表达载体的构建方案第83-84页
                        1.2.2.4.1 Crypt基因第83-84页
                        1.2.2.4.2 CryK13V基因第84页
                1.2.3 植物双元表达载体导入根癌农杆菌EHA105第84-85页
                    1.2.3.1 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备第84-85页
                    1.2.3.2 转化(冻融法)第85页
                    1.2.3.3 重组转化子的鉴定第85页
        2 结果与分析第85-87页
            2.1 Crypt基因植物双元表达载体的构建第85-86页
                2.1.1 Crypt基因的克隆及序列测定第85-86页
                2.1.2 Crypt融合基因植物双元表达载体的构建第86页
            2.2 CryK13V基因植物双元表达载体的构建第86页
                2.2.1 CryK13V基因的获得及序列测定第86页
                2.2.2 CryK13V融合基因植物双元表达载体的构建第86页
            2.3 根癌农杆菌的转化与鉴定第86-87页
                2.3.1 含Crypt基因的植物双元表达载体转化根癌农杆菌EHA105第86-87页
                2.3.2 含CryK13V基因的植物双元表达载体转化根癌农杆菌EHA105第87页
        3 讨论第87-90页
            3.1 启动子的选择第87页
            3.2 Crypt蛋白的13氨基酸位定点突变第87-88页
            3.3 信号肽第88页
            3.4 激发子基因第88-90页
        参考文献第90-99页
    第四章 Crypt和CryK13V基因的烟草转化及转基因植株的获得第99-121页
        1 材料第99-100页
            1.1 转化的受体植物第99页
            1.2 菌株与质粒第99页
            1.3 培养基与抗生素第99-100页
        2 方法第100-109页
            2.1 烟草叶片感染与卡那抗性植株的再生第100-101页
                2.1.1 农杆菌的培养第100页
                2.1.2 烟草叶片的准备第100页
                2.1.3 预培养第100页
                2.1.4 农杆菌侵染第100页
                2.1.5 共培养、筛选培养、继代培养第100页
                2.1.6 生根培养第100-101页
                2.1.7 土壤种植第101页
            2.2 转基因烟草的分子生物学鉴定第101-109页
                2.2.1 PCR检测第101-103页
                    2.2.1.1 烟草基因组DNA的提取第101-102页
                    2.2.1.2 PCR检测第102-103页
                2.2.2 Southern blot分析第103-106页
                    2.2.2.1 烟草基因组DNA的提取第103页
                    2.2.2.2 烟草基因组DNA的酶切第103-104页
                    2.2.2.3 电泳及转膜第104页
                    2.2.2.4 探针的制备第104-105页
                    2.2.2.5 Southern blot分析第105-106页
                    2.2.2.6 脱探针第106页
                2.2.3 Northern blot杂交分析第106-108页
                    2.2.3.1 器皿和容器的处理第106页
                    2.2.3.2 烟草总RNA的提取第106-107页
                    2.2.3.3 甲醛变性电泳第107页
                    2.2.3.4 RNA转膜第107-108页
                    2.2.3.5 探针的制备第108页
                    2.2.3.6 Northern blot分析第108页
                2.2.4 RT-PCR检测第108-109页
                    2.2.4.1 总RNA的提取第108页
                    2.2.4.2 第一链cDNA的合成第108-109页
                    2.2.4.3 PCR扩增第109页
        3 结果与分析第109-111页
            3.1 Crypt和CryK13V基因的烟草转化及卡那抗性植株的获得第109页
            3.2 Crypt和CryK13V基因与烟草基因组DNA的整合第109-110页
                3.2.1 PCR检测第109页
                3.2.2 转基因烟草的Southern blot分析第109-110页
            3.3 Crypt和CryK13V基因在烟草植株中的转录第110-111页
                3.3.1 Northern blot分析第110页
                3.3.2 RT-PCR检测第110-111页
        4 讨论第111-114页
            4.1 影响转化效率的主要因素第111-112页
            4.2 Crypt蛋白13位氨基酸在诱导细胞坏死中的作用第112-113页
            4.3 外源基因的转录第113-114页
        参考文献第114-121页
    第五章 Cryptogein基因功能的初步分析第121-146页
        1 材料与方法第121-127页
            1.1 材料第121-123页
                1.1.1 供试植物第121页
                1.1.2 供试病原菌第121-123页
                1.1.3 培养基第123页
            1.2 方法第123-127页
                1.2.1 转Crypt基因和CryK13V基因烟草(T_0、T_1代)抗病性测定第123-127页
                    1.2.1.1 黑胫病菌(P. parasitica var nicotianae, Ppn)第123-125页
                        1.2.1.1.1 Ppn的培养第123页
                        1.2.1.1.2 接种方法第123-124页
                        1.2.1.1.3 黑胫病严重度的划分标准第124-125页
                    1.2.1.2 赤星病菌(A. alternata, Aa)第125-126页
                        1.2.1.2.1 Aa的培养第125页
                        1.2.1.2.2 接种方法第125页
                        1.2.1.2.3 赤星病严重度的划分标准第125-126页
                    1.2.1.3 野火病菌(P. syringae pv tobaci, Pst)第126-127页
                        1.2.1.3.1 Pst的培养第126页
                        1.2.1.3.2 接种方法第126页
                        1.2.1.3.3 野火病菌在叶片内繁殖速度的测定第126页
                        1.2.1.3.4 野火病严重度的划分标准第126-127页
                1.2.2 转基因烟草植株耐盐性分析第127页
                1.2.3 T0、T1代转基因烟草植株农艺性状考察第127页
        2 结果与分析第127-135页
            2.1 T0、T1代转基因烟草植株的抗病性分析第127-132页
                2.1.1 烟草黑胫病第127-129页
                2.1.2 烟草赤星病第129-130页
                2.1.3 烟草野火病第130-131页
                2.1.4 T0、T1代转基因烟草植株对黑胫病、赤星病和野火病的抗性反应第131-132页
            2.2 转基因烟草的耐盐性显著增强第132-134页
            2.3 转Crypt和CryK13V基因的烟草植株其他农艺性状的变化第134-135页
                2.3.1 苗期促进发棵,长势明显增强第134页
                2.3.2 成长期促进生长,增加植株高度第134页
                2.3.3 生育期缩短,促进开花第134页
                2.3.4 少数转基因烟草植株生长异常第134页
                2.3.5 少数转基因烟草植株现蕾、开花、结籽表现异常第134-135页
        3 讨论第135-138页
            3.1 细胞死亡(HR)与防卫反应的建立第135-136页
            3.2 耐盐性第136-137页
            3.3 Crypt和CryK13V基因的功能第137-138页
        参考文献第138-146页
    第六章 Crypt和CryK13V基因介导的烟草抗病和耐盐分子机理初探第146-158页
        1 材料与方法第146-147页
            1.1 材料第146页
                1.1.1 烟草第146页
                1.1.2 病原菌第146页
            1.2 方法第146-147页
                1.2.1 Ppn的培养第146页
                1.2.2 PR-1α基因的诱导表达第146-147页
                1.2.3 转基因烟草植株总RNA的提取和Northern blot分析第147页
                1.2.4 杂交探针第147页
        2 结果与分析第147-151页
            2.1 T0代转基因烟草植株PR-1α基因的表达与抗病性第147-148页
            2.2 PR-1α基因的组成型表达与转基因烟草植株的抗病性第148-149页
            2.3 PR-1α基因的诱导表达与转基因烟草植株抗病性第149-150页
            2.4 转录因子OPBP1的活化与转基因烟草植株耐盐、抗病性第150页
            2.5 渗调蛋白PR5基因的表达与转基因烟草植株的耐盐性第150-151页
        3 讨论第151-153页
            3.1 防卫反应相关基因的表达与抗病性第151-152页
                3.1.1 PR及基因和其它防卫反应相关基因的表达增强了转基因烟草抗病的能力第151页
                3.1.2 防卫反应相关基因快速和超量诱导表达是转基因烟草植株抵抗病原菌侵入的又一种机制第151-152页
            3.2 防卫反应相关基因的表达与耐盐性第152-153页
        参考文献第153-158页
    第七章 转Crypt和CryK13V基因烟草植株的遗传分析第158-170页
        1 材料与方法第158-160页
            1.1 材料第158-159页
                1.1.1 供试植物第158-159页
                1.1.2 供试病原菌第159页
                1.1.3 培养基第159页
            1.2 方法第159-160页
                1.2.1 T1代转基因种子卡那霉素抗性遗传分析第159页
                1.2.2 T1代转基因烟草植株的PCR检测第159-160页
                1.2.3 T1代转基因烟草植株的抗病性测定第160页
        2 结果与分析第160-163页
            2.1 T1代转基因烟草植株的遗传方式第160页
            2.2 T1代转基因烟草植株的PCR检测第160页
            2.3 转基因烟草植株整合拷贝数及其与抗黑胫病的相关性第160-162页
            2.4 T0代、T1代转基因烟草植株抗病性的相关性分析第162-163页
        3 讨论第163-166页
            3.1 外源基因整合的拷贝数与其表达水平的关系第163页
            3.2 转基因在烟草植株中的遗传特点第163-164页
            3.3 转基因的复杂性和多样性第164-166页
        参考文献第166-170页
全文小结第170-171页
附录A: 本论文所用缩写词及中英文对照第171-172页
附录B: 主要化学试剂及缓冲液配制第172-173页
附录C: 常用培养基配方第173-175页
附录D: 常用的抗生素及使用浓度第175-176页
附录E: 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器第176页

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