致谢 | 第4-16页 |
中文摘要 | 第16-18页 |
英文摘要 | 第18页 |
第一部分 文献综述 | 第21-70页 |
第一章 植物病原菌激发子与抗病防卫反应 | 第22-43页 |
1 引言 | 第22页 |
2 激发子的种类和性质 | 第22-26页 |
2.1 寡糖 | 第23-24页 |
2.1.1 寡聚半乳糖醛酸 | 第23页 |
2.1.2 几丁质及其衍生物 | 第23页 |
2.1.3 葡聚糖 | 第23-24页 |
2.1.4 脂多糖 | 第24页 |
2.2 糖蛋白 | 第24-25页 |
2.2.1 疫霉糖蛋白 | 第24页 |
2.2.2 酵母糖蛋白 | 第24-25页 |
2.2.3 锈菌糖蛋白 | 第25页 |
2.3 多肽和蛋白质 | 第25-26页 |
2.3.1 激发素 | 第25页 |
2.3.2 harpins | 第25-26页 |
2.3.3 无毒蛋白 | 第26页 |
2.3.4 鞭毛蛋白 | 第26页 |
2.3.5 病毒蛋白 | 第26页 |
2.3.6 其它蛋白 | 第26页 |
3 病菌激发子—受体识别机制 | 第26-29页 |
3.1 激发子受体 | 第26-27页 |
3.2 病原激发子—受体识别 | 第27-28页 |
3.3 “保卫假说” | 第28-29页 |
4 信号识别、传导、防卫反应产生过程中植物与动物的相似性 | 第29-31页 |
4.1 受体蛋白的结构 | 第29-30页 |
4.2 磷酸化与脱磷酸化 | 第30页 |
4.3 其它调控分子 | 第30-31页 |
5 激发子诱导的抗病防卫反应基因表达的调控 | 第31-35页 |
5.1 顺式作用元件的调控 | 第32-33页 |
5.1.1 GCC盒 | 第32页 |
5.1.2 As-1 | 第32-33页 |
5.1.3 W盒 | 第33页 |
5.1.4 G盒和H盒 | 第33页 |
5.2 转录因子表达的调控和活性的调节 | 第33-35页 |
5.2.1 转录调控 | 第33-34页 |
5.2.2 细胞核定位 | 第34页 |
5.2.3 转录因子修饰 | 第34页 |
5.2.4 转录因子间互作 | 第34-35页 |
参考文献 | 第35-43页 |
第二章 激发素(elicitins)研究进展 | 第43-70页 |
1 引言 | 第43页 |
2 elicitins的发现 | 第43-44页 |
3 elicitins的基本结构和理化性质 | 第44-47页 |
3.1 elicitins的一级结构 | 第44-46页 |
3.2 elicitins的高级结构 | 第46-47页 |
3.3 elicitins的理化性质 | 第47页 |
4 elicitins的生物学作用 | 第47-50页 |
4.1 elicitins与HR反应 | 第47-48页 |
4.2 α、β-elicitins诱导烟草HR反应差异的几种解释 | 第48-49页 |
4.2.1 移动性 | 第48页 |
4.2.2 与烟草细胞膜的受体亲和力和结合位点数目 | 第48-49页 |
4.2.3 与elicitins所带的净电荷 | 第49页 |
4.3 elicitins诱导的抗病性(SAR)和基因工程 | 第49-50页 |
4.3.1 用elicitins蛋白直接处理诱导的抗病性 | 第49-50页 |
4.3.2 elicitins基因转化产生的抗病性 | 第50页 |
5 elicitins诱导的防卫信号传导 | 第50-53页 |
5.1 elicitins的受体 | 第50-51页 |
5.2 elicitins引发的防卫信号传导 | 第51-53页 |
6 elicitins诱导HR和SAR的寄主专化性 | 第53-54页 |
6.1 elicitins具有寄主专化性 | 第53-54页 |
6.2 elicitins寄主专化性不强 | 第54页 |
7 elicitins在疫霉菌致病性和生活史中的作用 | 第54-56页 |
8 elicitins的基因结构 | 第56-57页 |
9 elicitins蛋白诱导HR的关键氨基酸位点 | 第57-58页 |
10 疫霉菌与植物的共进化—防御与反防御反应的统一 | 第58-60页 |
参考文献 | 第60-70页 |
第二部分 实验研究 | 第70-170页 |
前言 | 第71-73页 |
第三章 隐地蛋白(Cryptogein)基因的克隆、定点突变及其植物双元表达载体的构建 | 第73-99页 |
1 材料与方法 | 第73-85页 |
1.1 材料 | 第73-74页 |
1.1.1 菌种、质粒 | 第73页 |
1.1.2 酶、化学试剂 | 第73页 |
1.1.3 抗生素 | 第73-74页 |
1.1.4 常用试剂的配制 | 第74页 |
1.2 方法 | 第74-85页 |
1.2.1 DNA分子操作常规技术 | 第74-79页 |
1.2.1.1 PCR产物的纯化 | 第74页 |
1.2.1.2 酶切产物(或PCR产物)割胶回收与纯化 | 第74-75页 |
1.2.1.3 PCR扩增产物的克隆 | 第75页 |
1.2.1.4 载体和目的基因片段的限制性内切酶酶切 | 第75-76页 |
1.2.1.5 载体和目的基因片段的连接 | 第76页 |
1.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第76-77页 |
1.2.1.6.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 | 第76-77页 |
1.2.1.6.2 转化 | 第77页 |
1.2.1.7 重组克隆的筛选与鉴定 | 第77-79页 |
1.2.1.7.1 重组质粒的提取(CTAB法) | 第77-78页 |
1.2.1.7.2 重组质粒的试剂盒提取(用UMIQ-10柱离心式质粒小量抽提试剂盒Sangon公司) | 第78页 |
1.2.1.7.3 重组质粒的试剂盒提取(用QIAprep Spinminiprep Kit, Qiagen公司) | 第78-79页 |
1.2.1.7.4 重组质粒的PCR鉴定 | 第79页 |
1.2.1.7.5 重组质粒的酶切鉴定 | 第79页 |
1.2.1.8 DNA序列测定及分析 | 第79页 |
1.2.2 植物双元表达载体的构建 | 第79-84页 |
1.2.2.1 目的基因的获得 | 第79-82页 |
1.2.2.1.1 Cryptogein基因的克隆 | 第79-81页 |
1.2.2.1.2 Cryptogein基因的PCR定点突变(pUC-CryK13V) | 第81-82页 |
1.2.2.1.3 烟草病程相关蛋白信号肽(PRs)基因的克隆 | 第82页 |
1.2.2.1.4 PAL启动子和35S启动子的获得 | 第82页 |
1.2.2.2 Crypt和CryK13V基因植物双元表达载体的构建策略 | 第82-83页 |
1.2.2.3 Crypt和CryK13V基因植物双元表达载体结构的设计 | 第83页 |
1.2.2.3.1 Crypt基因 | 第83页 |
1.2.2.3.2 CryK13V基因 | 第83页 |
1.2.2.4 Crypt基因和CryK13V基因植物双元表达载体的构建方案 | 第83-84页 |
1.2.2.4.1 Crypt基因 | 第83-84页 |
1.2.2.4.2 CryK13V基因 | 第84页 |
1.2.3 植物双元表达载体导入根癌农杆菌EHA105 | 第84-85页 |
1.2.3.1 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备 | 第84-85页 |
1.2.3.2 转化(冻融法) | 第85页 |
1.2.3.3 重组转化子的鉴定 | 第85页 |
2 结果与分析 | 第85-87页 |
2.1 Crypt基因植物双元表达载体的构建 | 第85-86页 |
2.1.1 Crypt基因的克隆及序列测定 | 第85-86页 |
2.1.2 Crypt融合基因植物双元表达载体的构建 | 第86页 |
2.2 CryK13V基因植物双元表达载体的构建 | 第86页 |
2.2.1 CryK13V基因的获得及序列测定 | 第86页 |
2.2.2 CryK13V融合基因植物双元表达载体的构建 | 第86页 |
2.3 根癌农杆菌的转化与鉴定 | 第86-87页 |
2.3.1 含Crypt基因的植物双元表达载体转化根癌农杆菌EHA105 | 第86-87页 |
2.3.2 含CryK13V基因的植物双元表达载体转化根癌农杆菌EHA105 | 第87页 |
3 讨论 | 第87-90页 |
3.1 启动子的选择 | 第87页 |
3.2 Crypt蛋白的13氨基酸位定点突变 | 第87-88页 |
3.3 信号肽 | 第88页 |
3.4 激发子基因 | 第88-90页 |
参考文献 | 第90-99页 |
第四章 Crypt和CryK13V基因的烟草转化及转基因植株的获得 | 第99-121页 |
1 材料 | 第99-100页 |
1.1 转化的受体植物 | 第99页 |
1.2 菌株与质粒 | 第99页 |
1.3 培养基与抗生素 | 第99-100页 |
2 方法 | 第100-109页 |
2.1 烟草叶片感染与卡那抗性植株的再生 | 第100-101页 |
2.1.1 农杆菌的培养 | 第100页 |
2.1.2 烟草叶片的准备 | 第100页 |
2.1.3 预培养 | 第100页 |
2.1.4 农杆菌侵染 | 第100页 |
2.1.5 共培养、筛选培养、继代培养 | 第100页 |
2.1.6 生根培养 | 第100-101页 |
2.1.7 土壤种植 | 第101页 |
2.2 转基因烟草的分子生物学鉴定 | 第101-109页 |
2.2.1 PCR检测 | 第101-103页 |
2.2.1.1 烟草基因组DNA的提取 | 第101-102页 |
2.2.1.2 PCR检测 | 第102-103页 |
2.2.2 Southern blot分析 | 第103-106页 |
2.2.2.1 烟草基因组DNA的提取 | 第103页 |
2.2.2.2 烟草基因组DNA的酶切 | 第103-104页 |
2.2.2.3 电泳及转膜 | 第104页 |
2.2.2.4 探针的制备 | 第104-105页 |
2.2.2.5 Southern blot分析 | 第105-106页 |
2.2.2.6 脱探针 | 第106页 |
2.2.3 Northern blot杂交分析 | 第106-108页 |
2.2.3.1 器皿和容器的处理 | 第106页 |
2.2.3.2 烟草总RNA的提取 | 第106-107页 |
2.2.3.3 甲醛变性电泳 | 第107页 |
2.2.3.4 RNA转膜 | 第107-108页 |
2.2.3.5 探针的制备 | 第108页 |
2.2.3.6 Northern blot分析 | 第108页 |
2.2.4 RT-PCR检测 | 第108-109页 |
2.2.4.1 总RNA的提取 | 第108页 |
2.2.4.2 第一链cDNA的合成 | 第108-109页 |
2.2.4.3 PCR扩增 | 第109页 |
3 结果与分析 | 第109-111页 |
3.1 Crypt和CryK13V基因的烟草转化及卡那抗性植株的获得 | 第109页 |
3.2 Crypt和CryK13V基因与烟草基因组DNA的整合 | 第109-110页 |
3.2.1 PCR检测 | 第109页 |
3.2.2 转基因烟草的Southern blot分析 | 第109-110页 |
3.3 Crypt和CryK13V基因在烟草植株中的转录 | 第110-111页 |
3.3.1 Northern blot分析 | 第110页 |
3.3.2 RT-PCR检测 | 第110-111页 |
4 讨论 | 第111-114页 |
4.1 影响转化效率的主要因素 | 第111-112页 |
4.2 Crypt蛋白13位氨基酸在诱导细胞坏死中的作用 | 第112-113页 |
4.3 外源基因的转录 | 第113-114页 |
参考文献 | 第114-121页 |
第五章 Cryptogein基因功能的初步分析 | 第121-146页 |
1 材料与方法 | 第121-127页 |
1.1 材料 | 第121-123页 |
1.1.1 供试植物 | 第121页 |
1.1.2 供试病原菌 | 第121-123页 |
1.1.3 培养基 | 第123页 |
1.2 方法 | 第123-127页 |
1.2.1 转Crypt基因和CryK13V基因烟草(T_0、T_1代)抗病性测定 | 第123-127页 |
1.2.1.1 黑胫病菌(P. parasitica var nicotianae, Ppn) | 第123-125页 |
1.2.1.1.1 Ppn的培养 | 第123页 |
1.2.1.1.2 接种方法 | 第123-124页 |
1.2.1.1.3 黑胫病严重度的划分标准 | 第124-125页 |
1.2.1.2 赤星病菌(A. alternata, Aa) | 第125-126页 |
1.2.1.2.1 Aa的培养 | 第125页 |
1.2.1.2.2 接种方法 | 第125页 |
1.2.1.2.3 赤星病严重度的划分标准 | 第125-126页 |
1.2.1.3 野火病菌(P. syringae pv tobaci, Pst) | 第126-127页 |
1.2.1.3.1 Pst的培养 | 第126页 |
1.2.1.3.2 接种方法 | 第126页 |
1.2.1.3.3 野火病菌在叶片内繁殖速度的测定 | 第126页 |
1.2.1.3.4 野火病严重度的划分标准 | 第126-127页 |
1.2.2 转基因烟草植株耐盐性分析 | 第127页 |
1.2.3 T0、T1代转基因烟草植株农艺性状考察 | 第127页 |
2 结果与分析 | 第127-135页 |
2.1 T0、T1代转基因烟草植株的抗病性分析 | 第127-132页 |
2.1.1 烟草黑胫病 | 第127-129页 |
2.1.2 烟草赤星病 | 第129-130页 |
2.1.3 烟草野火病 | 第130-131页 |
2.1.4 T0、T1代转基因烟草植株对黑胫病、赤星病和野火病的抗性反应 | 第131-132页 |
2.2 转基因烟草的耐盐性显著增强 | 第132-134页 |
2.3 转Crypt和CryK13V基因的烟草植株其他农艺性状的变化 | 第134-135页 |
2.3.1 苗期促进发棵,长势明显增强 | 第134页 |
2.3.2 成长期促进生长,增加植株高度 | 第134页 |
2.3.3 生育期缩短,促进开花 | 第134页 |
2.3.4 少数转基因烟草植株生长异常 | 第134页 |
2.3.5 少数转基因烟草植株现蕾、开花、结籽表现异常 | 第134-135页 |
3 讨论 | 第135-138页 |
3.1 细胞死亡(HR)与防卫反应的建立 | 第135-136页 |
3.2 耐盐性 | 第136-137页 |
3.3 Crypt和CryK13V基因的功能 | 第137-138页 |
参考文献 | 第138-146页 |
第六章 Crypt和CryK13V基因介导的烟草抗病和耐盐分子机理初探 | 第146-158页 |
1 材料与方法 | 第146-147页 |
1.1 材料 | 第146页 |
1.1.1 烟草 | 第146页 |
1.1.2 病原菌 | 第146页 |
1.2 方法 | 第146-147页 |
1.2.1 Ppn的培养 | 第146页 |
1.2.2 PR-1α基因的诱导表达 | 第146-147页 |
1.2.3 转基因烟草植株总RNA的提取和Northern blot分析 | 第147页 |
1.2.4 杂交探针 | 第147页 |
2 结果与分析 | 第147-151页 |
2.1 T0代转基因烟草植株PR-1α基因的表达与抗病性 | 第147-148页 |
2.2 PR-1α基因的组成型表达与转基因烟草植株的抗病性 | 第148-149页 |
2.3 PR-1α基因的诱导表达与转基因烟草植株抗病性 | 第149-150页 |
2.4 转录因子OPBP1的活化与转基因烟草植株耐盐、抗病性 | 第150页 |
2.5 渗调蛋白PR5基因的表达与转基因烟草植株的耐盐性 | 第150-151页 |
3 讨论 | 第151-153页 |
3.1 防卫反应相关基因的表达与抗病性 | 第151-152页 |
3.1.1 PR及基因和其它防卫反应相关基因的表达增强了转基因烟草抗病的能力 | 第151页 |
3.1.2 防卫反应相关基因快速和超量诱导表达是转基因烟草植株抵抗病原菌侵入的又一种机制 | 第151-152页 |
3.2 防卫反应相关基因的表达与耐盐性 | 第152-153页 |
参考文献 | 第153-158页 |
第七章 转Crypt和CryK13V基因烟草植株的遗传分析 | 第158-170页 |
1 材料与方法 | 第158-160页 |
1.1 材料 | 第158-159页 |
1.1.1 供试植物 | 第158-159页 |
1.1.2 供试病原菌 | 第159页 |
1.1.3 培养基 | 第159页 |
1.2 方法 | 第159-160页 |
1.2.1 T1代转基因种子卡那霉素抗性遗传分析 | 第159页 |
1.2.2 T1代转基因烟草植株的PCR检测 | 第159-160页 |
1.2.3 T1代转基因烟草植株的抗病性测定 | 第160页 |
2 结果与分析 | 第160-163页 |
2.1 T1代转基因烟草植株的遗传方式 | 第160页 |
2.2 T1代转基因烟草植株的PCR检测 | 第160页 |
2.3 转基因烟草植株整合拷贝数及其与抗黑胫病的相关性 | 第160-162页 |
2.4 T0代、T1代转基因烟草植株抗病性的相关性分析 | 第162-163页 |
3 讨论 | 第163-166页 |
3.1 外源基因整合的拷贝数与其表达水平的关系 | 第163页 |
3.2 转基因在烟草植株中的遗传特点 | 第163-164页 |
3.3 转基因的复杂性和多样性 | 第164-166页 |
参考文献 | 第166-170页 |
全文小结 | 第170-171页 |
附录A: 本论文所用缩写词及中英文对照 | 第171-172页 |
附录B: 主要化学试剂及缓冲液配制 | 第172-173页 |
附录C: 常用培养基配方 | 第173-175页 |
附录D: 常用的抗生素及使用浓度 | 第175-176页 |
附录E: 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 | 第176页 |