| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第13-22页 |
| 1.1 课题研究背景 | 第13-14页 |
| 1.2 生物固氮 | 第14-16页 |
| 1.2.1 固氮酶的结构及命名 | 第14-15页 |
| 1.2.2 固氮酶的特性 | 第15-16页 |
| 1.2.3 固氮酶的催化机理 | 第16页 |
| 1.3 生物固氮类型 | 第16-19页 |
| 1.3.1 植物内生固氮菌 | 第17页 |
| 1.3.2 植物内生固氮菌为植物提供氮源 | 第17-18页 |
| 1.3.3 植物内生固氮菌的促生作用 | 第18页 |
| 1.3.4 植物内生固氮提高植物的抗逆性 | 第18-19页 |
| 1.3.5 植物内生固氮的溶磷作用 | 第19页 |
| 1.4 甘蔗内生固氮研究 | 第19页 |
| 1.5 本研究的目的意义 | 第19-21页 |
| 1.6 技术路线 | 第21-22页 |
| 2 DX120E固氮酶(nifH,nifD,nifK)基因的克隆 | 第22-46页 |
| 2.1 材料 | 第22-24页 |
| 2.1.1 试验材料 | 第22页 |
| 2.1.2 试验试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 菌种及克隆载体 | 第22-24页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第24页 |
| 2.1.5 培养基 | 第24页 |
| 2.2 方法 | 第24-29页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第24-25页 |
| 2.2.2 nifH,nifD基因开放阅读框的PCR扩增 | 第25-26页 |
| 2.2.3 nifK基因开放阅读框PCR的扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.4 回收纯化目的片段 | 第27页 |
| 2.2.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制作及转化 | 第27页 |
| 2.2.6 目的片段的连接及转化 | 第27-28页 |
| 2.2.7 阳性克隆的鉴定 | 第28页 |
| 2.2.8 生物信息学分析 | 第28-29页 |
| 2.3 结果与分析 | 第29-45页 |
| 2.3.1 nifH基因的克隆 | 第29页 |
| 2.3.2 nifH基因序列分析 | 第29-30页 |
| 2.3.3 nifH基因生物信息学分析 | 第30-35页 |
| 2.3.4 nifD基因的克隆 | 第35页 |
| 2.3.5 nifD基因的序列分析 | 第35-36页 |
| 2.3.6 nifD基因生物信息学分析 | 第36-40页 |
| 2.3.7 nifK基因的克隆 | 第40页 |
| 2.3.8 nifK基因的序列分析 | 第40-41页 |
| 2.3.9 nifK基因的生物信息学分析 | 第41-45页 |
| 2.4 小结 | 第45-46页 |
| 3. DX120E固氮酶(nifH,nifD,nifK)基因的原核表达 | 第46-56页 |
| 3.1 材料 | 第46页 |
| 3.1.1 菌种及载体 | 第46页 |
| 3.1.2 试剂 | 第46页 |
| 3.1.3 主要仪器设备 | 第46页 |
| 3.1.4 培养基 | 第46页 |
| 3.2 方法 | 第46-50页 |
| 3.2.1 质粒的大量提取 | 第46页 |
| 3.2.2 酶切重组质粒及原核表达载体质粒 | 第46-47页 |
| 3.2.3 目的片段与表达载体的连接 | 第47页 |
| 3.2.4 转化大肠杆菌DH5a | 第47页 |
| 3.2.5 阳性克隆的筛选及测序 | 第47-48页 |
| 3.2.6 重组质粒的提取及验证 | 第48页 |
| 3.2.7 BL21感受态细胞的制作 | 第48页 |
| 3.2.8 重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3) | 第48页 |
| 3.2.9 蛋白的表达 | 第48-49页 |
| 3.2.10 SDS-PAGE电泳检测目的蛋白 | 第49-50页 |
| 3.2.11 包涵体的确定 | 第50页 |
| 3.2.12 蛋白的质谱鉴定 | 第50页 |
| 3.3 结果与分析 | 第50-56页 |
| 3.3.1 原核表达载体的构建及验证 | 第50-51页 |
| 3.3.2 SDS-PAGE分析 | 第51-53页 |
| 3.3.3 包涵体的确定 | 第53-54页 |
| 3.3.4 蛋白的质谱鉴定 | 第54-56页 |
| 3.4 小结 | 第56页 |
| 4 nifH基因表达量的分析 | 第56-62页 |
| 4.1 材料 | 第56-57页 |
| 4.1.1 试验材料 | 第56-57页 |
| 4.1.2 供试菌株 | 第57页 |
| 4.1.3 仪器及用具 | 第57页 |
| 4.1.4 主要试剂及配制 | 第57页 |
| 4.2 方法 | 第57-59页 |
| 4.2.1 菌悬液的制备 | 第57页 |
| 4.2.2 接种处理 | 第57-58页 |
| 4.2.3 组培苗蛋白质酚抽提 | 第58页 |
| 4.2.4 提取蛋白的SDS-PAGE电泳检测 | 第58页 |
| 4.2.5 Western blot半干转膜详细操作流程 | 第58-59页 |
| 4.3 结果与分析 | 第59-61页 |
| 4.3.1 DX120E和ROC22共培养组培苗的获得 | 第59-60页 |
| 4.3.2 组培苗提取蛋白SDS-PAGE分析 | 第60页 |
| 4.3.3 Western blot检测nifH基因的表达量 | 第60-61页 |
| 4.4 小结 | 第61-62页 |
| 5 讨论与结论 | 第62-65页 |
| 5.1 全文讨论 | 第62-64页 |
| 5.1.1 DX120E nifH基因的克隆及序列分析 | 第62页 |
| 5.1.2 DX120E nifD基因的克隆及序列分析 | 第62-63页 |
| 5.1.3 DX120E nifK基因的克隆及序列分析 | 第63页 |
| 5.1.4 DX120E固氮酶(nifH,nifD,nifK)基因的原核表达 | 第63-64页 |
| 5.1.5 NifH基因的Western bolt检测 | 第64页 |
| 5.2 全文结论 | 第64页 |
| 5.3 论文创新点 | 第64-65页 |
| 6 下一步计划 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-75页 |
| 附录 | 第75页 |
