| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-24页 |
| 1.1 CRISPR/Cas基因组定点编辑技术的建立 | 第12-15页 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas系统的发现与分类 | 第12-13页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas9系统的作用机制 | 第13-14页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9技术的发展及成熟 | 第14-15页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9技术在转基因动物中的应用 | 第15-19页 |
| 1.2.1 在基因敲除中的应用 | 第15-16页 |
| 1.2.2 在基因定点整合中的应用 | 第16-17页 |
| 1.2.3 在基因转录调控中的应用 | 第17-18页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9技术相比其他基因编辑技术的应用优势 | 第18-19页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9的脱靶效应及改进措施的研究 | 第19-20页 |
| 1.4 结语 | 第20-24页 |
| 参考文献 | 第20-24页 |
| 第二章 CRISPR/Cas9表达载体的构建 | 第24-36页 |
| 2.1 材料 | 第24-26页 |
| 2.1.1 主要仪器设备 | 第24-25页 |
| 2.1.2 化学试剂与耗材 | 第25页 |
| 2.1.3 实验材料 | 第25-26页 |
| 2.2 方法 | 第26-29页 |
| 2.2.1 靶位点的选取及gRNA的设计 | 第26页 |
| 2.2.2 潜在脱靶位点的确定 | 第26-27页 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9骨架载体的构建 | 第27-29页 |
| 2.2.4 靶位点基因PCR引物设计及反应条件优化 | 第29页 |
| 2.3 结果 | 第29-34页 |
| 2.3.1 靶位点的选取与sgRNA的确定 | 第29-30页 |
| 2.3.2 脱靶位点的确定 | 第30-31页 |
| 2.3.3 CRISPR/Cas9骨架载体的构建及测序验证 | 第31-33页 |
| 2.3.4 靶位点基因PCR引物设计及条件优化 | 第33-34页 |
| 2.4 讨论 | 第34-36页 |
| 第三章 定点敲除FGF5基因的内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞系筛选及脱靶位点的验证 | 第36-57页 |
| 3.1 材料 | 第36-38页 |
| 3.1.1 主要仪器设备 | 第36-37页 |
| 3.1.2 化学试剂与耗材 | 第37页 |
| 3.1.3 实验材料 | 第37-38页 |
| 3.2 方法 | 第38-48页 |
| 3.2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞脂质体转染体系的优化 | 第38页 |
| 3.2.2 CRISPR/Cas9表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞 | 第38-39页 |
| 3.2.3 SURVEYOR酶切活性验证及体系的优化 | 第39-41页 |
| 3.2.4 Surveyor酶切验证转染后的绒山羊胎儿成纤维细胞系pool克隆 | 第41-45页 |
| 3.2.5 测序验证转染后的绒山羊胎儿成纤维细胞系pool克隆 | 第45页 |
| 3.2.6 FGF5基因敲除突变单克隆的获得 | 第45-47页 |
| 3.2.7 FGF5基因敲除单克隆测序验证 | 第47-48页 |
| 3.2.8 脱靶位点的验证 | 第48页 |
| 3.3 结果 | 第48-55页 |
| 3.3.1 脂质体法转染条件的优化 | 第48-49页 |
| 3.3.2 SURVEYOR酶切活性验证及体系的优化 | 第49-50页 |
| 3.3.3 转染CRISPR/Cas9特异性表达载体后pool克隆Surveyor酶切验证 | 第50-51页 |
| 3.3.4 转染CRISPR/Cas9特异性表达载体后pool克隆测序验证 | 第51-53页 |
| 3.3.5 敲除FGF5基因绒山羊胎儿成纤维细胞阳性单克隆细胞系的获得及鉴定 | 第53-54页 |
| 3.3.6 潜在脱靶位点的验证 | 第54-55页 |
| 3.4 讨论 | 第55-57页 |
| 结论 | 第57-58页 |
| 攻读硕士学位期间所发表的学术论文 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
