| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-10页 |
| 目录 | 第10-13页 |
| 缩略语简表 | 第13-14页 |
| 第一部分 文献回顾 | 第14-25页 |
| 1 学术背景 | 第14-24页 |
| ·细胞骨架与肿瘤的关系 | 第14页 |
| ·Fascin生物学 | 第14-21页 |
| ·Fascin的发现与分类 | 第14-15页 |
| ·fascin基因 | 第15-16页 |
| ·Fascin蛋白的结构及表达分布 | 第16-17页 |
| ·Fascin蛋白的生物学功能 | 第17页 |
| ·Fascin的功能调控 | 第17-18页 |
| ·Fascin蛋白与肿瘤的关系 | 第18-20页 |
| ·Fascin在肿瘤细胞中过表达的机制研究进展 | 第20-21页 |
| ·基因表达调控研究进展 | 第21-24页 |
| 2 本项研究课题的学术背景及问题的提出 | 第24-25页 |
| 第二部分 食管癌细胞中fascin基因上游调控区的初步鉴定 | 第25-50页 |
| 1 引言 | 第25-26页 |
| 2 材料试剂与仪器设备 | 第26-30页 |
| ·质粒、菌株和实验试剂 | 第26-27页 |
| ·仪器与设备 | 第27-30页 |
| 3.实验方法与步骤 | 第30-50页 |
| ·技术路线 | 第30-31页 |
| ·方法 | 第31-43页 |
| ·细胞培养 | 第31页 |
| ·食管癌细胞系EC109全基因组DNA提取 | 第31-32页 |
| ·fascin基因5′上游调控区的PCR扩增 | 第32页 |
| ·PCR产物克隆至T载体 | 第32-33页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·连接产物转化JM109感受态细胞 | 第33页 |
| ·阳性克隆筛选 | 第33-35页 |
| ·fascin基因5′侧翼区系列缺失片段的PCR扩增 | 第35-37页 |
| ·系列缺失荧光素酶报告基因重组表达载体的构建 | 第37-41页 |
| ·重组质粒的细胞转染 | 第41-42页 |
| ·双荧光素酶报告基因活性检测 | 第42-43页 |
| ·结果 | 第43-50页 |
| ·EC109细胞基因组DNA电泳图 | 第43-44页 |
| ·fascin基因5’侧翼区3022片段的扩增及T/A克隆结果鉴定 | 第44-45页 |
| ·fascin基因5’侧翼区的分段扩增及T/A克隆结果鉴定 | 第45-47页 |
| ·系列缺失荧光素酶报告基因重组表达载体构建 | 第47页 |
| ·相对荧光素酶活性检测结果 | 第47-49页 |
| ·生物信息学分析结果 | 第49-50页 |
| 第三部分 食管癌细胞中fascin基因核心启动子区的初步鉴定 | 第50-58页 |
| 1 技术路线 | 第50-51页 |
| 2 方法步骤 | 第51-55页 |
| ·用嵌套缺失的方法制备系列嵌套缺失子 | 第51-54页 |
| ·准备超螺旋状质粒pBF-1435 | 第51页 |
| ·验证所提取质粒中是否有单链缺口的质粒存在 | 第51页 |
| ·测定质粒含量 | 第51页 |
| ·用Mlul对pBF-1435进行单酶切 | 第51-52页 |
| ·将上述回收的pBF-1435-M进行KpnI酶切 | 第52页 |
| ·对所得pBF-1435-M/K进行嵌套缺失反应 | 第52-53页 |
| ·筛选与鉴定阳性缺失子克隆 | 第53-54页 |
| ·EC109细胞转染 | 第54-55页 |
| ·双荧光素酶活性检测及结果分析 | 第55页 |
| 3 结果 | 第55-58页 |
| ·以pBF-1435为模板构建系列嵌套缺失质粒的PCR法鉴定结果 | 第55页 |
| ·双荧光素酶检测结果及分析 | 第55-57页 |
| ·生物信息学分析结果 | 第57-58页 |
| 第四部分 食管癌细胞中fascin基因核心启动子区内关键调控元件的初步鉴定 | 第58-73页 |
| 1 技术路线 | 第58页 |
| 2 方法步骤 | 第58-65页 |
| ·PCR方法构建系列调控元件缺失荧光素酶报告基因重组表达载体 | 第58-60页 |
| ·PCR扩增fascin基因5′上游调控区系列调控元件缺失片段 | 第58-60页 |
| ·PCR产物的T/A克隆 | 第60页 |
| ·连接产物阳性克隆筛选 | 第60页 |
| ·系列调控元件缺失的荧光素酶报告基因重组表达载体构建 | 第60页 |
| ·阳性克隆筛选 | 第60页 |
| ·酶切法构建系列调控元件缺失的荧光素酶报告基因重组表达载体 | 第60-64页 |
| ·fascin上游调控区-387区段限制性酶切位点的生物信息学分析 | 第61页 |
| ·酶切处理pBF-387,构建系列调控元件缺失重组表达载体 | 第61-64页 |
| ·AatⅡ单酶切获得CREB元件缺失质粒 | 第62-63页 |
| ·双酶切获得两种元件或三种元件共同缺失的表达载体 | 第63-64页 |
| ·细胞转染及双荧光素酶报告基因活性检测 | 第64-65页 |
| 3 结果 | 第65-73页 |
| ·系列调控元件缺失片段及重组质粒pTF-255～-40的鉴定 | 第65页 |
| ·PCR法构建系列调控元件缺失荧光素酶报告基因表达载体的鉴定 | 第65-67页 |
| ·酶切法构建系列调控元件缺失荧光素酶报告基因表达载体的鉴定 | 第67-71页 |
| ·系列元件缺失表达载体转染EC109细胞相对荧光素酶活性检测结果 | 第71-73页 |
| 小结 | 第73-75页 |
| 1 fascin基因5′上游转录调控区的基本启动子活性 | 第73页 |
| 2 EC109细胞中fascin基因的核心启动子区 | 第73-74页 |
| 3 EC109细胞中fascin基因核心启动子区内的关键调控元件 | 第74-75页 |
| 讨论 | 第75-79页 |
| 参考文献 | 第79-85页 |
| 附录试剂配制 | 第85-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 硕士研究生期间发表的论文 | 第93页 |
