| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-12页 |
| 硬脂酰CoA去饱和酶研究进展 | 第12-21页 |
| ·SCD催化机理与基因亚型 | 第12-13页 |
| ·SCD表达与脂肪合成 | 第13-15页 |
| ·SCD与脂肪酸β氧化 | 第15-16页 |
| ·SCD与肝脏脂肪变性 | 第16-18页 |
| ·SCD与动脉粥样硬化 | 第18页 |
| ·营养物质对SCD表达的调节 | 第18-20页 |
| ·采食对对SCD表达的调节 | 第18页 |
| ·多不饱和脂肪酸对SCD表达的影响 | 第18-19页 |
| ·共轭亚油酸对SCD表达的影响 | 第19页 |
| ·维生素A对SCD表达的影响 | 第19-20页 |
| ·药物对SCD表达的影响 | 第20页 |
| ·研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 实验一 犊牛肝细胞的分离、培养与生物活性观察 | 第21-29页 |
| 1 材料与方法 | 第21-24页 |
| ·材料 | 第21-22页 |
| ·试验动物 | 第21页 |
| ·试验试剂及试剂配置 | 第21-22页 |
| ·仪器仪器 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-23页 |
| ·两步灌流法分离犊牛肝脏细胞 | 第22-23页 |
| ·台盼蓝拒染检测细胞活性与细胞计数 | 第23页 |
| ·犊牛肝细胞的培养 | 第23页 |
| ·细胞白蛋白、尿素氮和乳酸脱氢酶检测 | 第23页 |
| ·统计学处理 | 第23-24页 |
| 2 结果 | 第24-26页 |
| ·犊牛肝细胞的分离 | 第24页 |
| ·形态学观察 | 第24-25页 |
| ·肝细胞功能测定 | 第25-26页 |
| ·尿素合成能力的测定 | 第25页 |
| ·白蛋白分泌量测定 | 第25-26页 |
| ·乳酸脱氢酶泄漏量测定 | 第26页 |
| 3 讨论 | 第26-28页 |
| ·肝细胞的体外制备 | 第26-27页 |
| ·肝细胞的培养方法 | 第27-28页 |
| ·肝细胞的鉴定 | 第28页 |
| 4 小结 | 第28-29页 |
| 实验二 硬脂酰CoA去饱和酶实时荧光定量RT-PCR的建立 | 第29-42页 |
| 1 材料 | 第29-30页 |
| ·组织 | 第29页 |
| ·试剂 | 第29页 |
| ·主要仪器 | 第29-30页 |
| ·引物的设计与合成 | 第30页 |
| ·培养基 | 第30页 |
| 2 方法 | 第30-36页 |
| ·目的基因cDNA的扩增及克隆测序 | 第30-34页 |
| ·无Rnase环境的创造 | 第30页 |
| ·总RNA的提取 | 第30-31页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第31页 |
| ·cDNA合成 | 第31-32页 |
| ·目的基因的PCR反应 | 第32页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第32页 |
| ·PCR产物的回收 | 第32页 |
| ·目的基因cDNA与载体的连接 | 第32页 |
| ·感受态菌的制备 | 第32-33页 |
| ·重组质粒的转化 | 第33页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第33页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的核苷酸序列测定与分析 | 第34页 |
| ·阳性参比样品的构建 | 第34-35页 |
| ·实时荧光定量PCR条件的优化 | 第35页 |
| ·循环条件优化 | 第35页 |
| ·退火温度优化 | 第35页 |
| ·引物浓度优化 | 第35页 |
| ·建立标准曲线 | 第35-36页 |
| 3 结果 | 第36-39页 |
| ·肝SCD和β-actin基因的克隆及测序 | 第36-37页 |
| ·肝脏总RNA的提取 | 第36页 |
| ·肝SCD mRNA和β-actin mRNA的RT-PCR扩增结果 | 第36页 |
| ·目的基因片段重组质粒的酶切和PCR鉴定及测序 | 第36-37页 |
| ·目的基因的荧光PCR标准曲线的建立 | 第37-39页 |
| ·内参基因β-actin PCR结果 | 第37-38页 |
| ·硬脂酰CoA去饱和酶(SCD)PCR结果 | 第38-39页 |
| 4 分析讨论 | 第39-41页 |
| ·定量PCR的定量方法 | 第39-40页 |
| ·SYBR Green Ⅰ染料的特点与不足 | 第40-41页 |
| 5 小结 | 第41-42页 |
| 实验三 胰岛素、高血糖素和神经肽Y对初生犊牛原代培养肝细胞中硬脂酰CoA去饱和酶mRNA的影响 | 第42-50页 |
| 1 材料 | 第42-43页 |
| ·材料 | 第42页 |
| ·主要试剂的配制 | 第42-43页 |
| ·胰岛素溶液的配制 | 第42页 |
| ·胰高血糖素的配制 | 第42-43页 |
| ·神经肽Y的配制 | 第43页 |
| 2 方法 | 第43-44页 |
| ·细胞培养与激素处理 | 第43页 |
| ·肝细胞单层原代培养 | 第43页 |
| ·肝细胞的处理 | 第43页 |
| ·肝细胞总RNA的提取 | 第43页 |
| ·肝细胞总RNA的反转录 | 第43页 |
| ·培养液中添加不同浓度激素的单层原代培养肝细胞中SCD mRNA实时荧光定量PCR测定 | 第43-44页 |
| ·数据处理 | 第44页 |
| 3 结果 | 第44-46页 |
| ·单层原代培养肝细胞总RNA电泳结果 | 第44页 |
| ·添加不同浓度代谢产物的单层原代培养肝细胞中SCDmRNA的荧光定量PCR的循环数与荧光强度的关系 | 第44-45页 |
| ·培养液中添加不同浓度神经内分泌因子的单层原代培养肝细胞中SCDmRNA表达荧光定量PCR的定量结果 | 第45-46页 |
| ·不同浓度的胰岛素对SCDmRNA表达的影响 | 第45页 |
| ·不同浓度的高血糖素对SCDmRNA表达的影响 | 第45页 |
| ·不同浓度的NPY对SCDmRNA表达的影响 | 第45-46页 |
| 4 讨论 | 第46-49页 |
| ·不同浓度的胰岛素对SCDmRNA表达的影响 | 第46-47页 |
| ·不同浓度的高血糖素对SCDmRNA表达的影响 | 第47-48页 |
| ·不同浓度的NPY对SCDmRNA表达的影响 | 第48-49页 |
| 5 小结 | 第49-50页 |
| 参考文献: | 第50-57页 |
| 致谢 | 第57-58页 |
