| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-10页 |
| 第一部分 前言 | 第10-33页 |
| 1 基因工程药物研究进展 | 第10-15页 |
| ·基因工程制药的概念和特点 | 第10-11页 |
| ·基因工程制药的概念和方法 | 第10-11页 |
| ·基因工程制药的特点 | 第11页 |
| ·基因工程制药的发展 | 第11-12页 |
| ·基因工程制药的发展历程 | 第11-12页 |
| ·基因工程制药的发展方向 | 第12页 |
| ·基因工程制药的发展、现状及面临的问题 | 第12-15页 |
| ·国外基因工程制药的发展及现状 | 第12-14页 |
| ·我国基因工程制药产业的发展现状及面临的问题 | 第14-15页 |
| 2 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体研究进展 | 第15-22页 |
| ·TRAIL的分子结构 | 第15-16页 |
| ·TRAIL的受体类型 | 第16-18页 |
| ·死亡受体 | 第16-17页 |
| ·诱骗受体 | 第17页 |
| ·OPG | 第17-18页 |
| ·TRAIL作用的分子机制 | 第18-20页 |
| ·死亡受体介导的凋亡通路 | 第18-19页 |
| ·NF-κB调控的凋亡通路 | 第19页 |
| ·正常细胞逃逸TRAIL杀伤作用的机制 | 第19-20页 |
| ·TRAIL在肿瘤治疗中的特点 | 第20页 |
| ·TRAIL的研究现状 | 第20-22页 |
| 3 外源基因在毕赤酵母表达系统中表达研究进展 | 第22-31页 |
| ·P.pastoris的生物学和遗传学特点 | 第22-23页 |
| ·表达菌株的构建 | 第23-27页 |
| ·表达载体 | 第24-25页 |
| ·可替换的启动子 | 第25-26页 |
| ·可选择的标记 | 第26页 |
| ·宿主菌 | 第26-27页 |
| ·表达载体向毕赤酵母基因组的整合 | 第27页 |
| ·影响外源蛋白表达的因素及提高外源蛋白表达的策略 | 第27-30页 |
| ·自主复制与表达盒的染色体整合 | 第28页 |
| ·表达盒的整合位点 | 第28页 |
| ·宿主的甲基营养表型：MUt~+或Mut~S | 第28页 |
| ·基因剂量 | 第28-29页 |
| ·mRNA5′-和3′-UTR | 第29页 |
| ·翻译起始密码子AUG前后的序列 | 第29页 |
| ·A+T组成 | 第29页 |
| ·产物稳定性 | 第29-30页 |
| ·密码子偏爱性 | 第30页 |
| ·KEX2p的影响 | 第30页 |
| ·影响表达产物活性的因素 | 第30-31页 |
| 4 本研究目的与意义 | 第31-32页 |
| 5 实验技术路线 | 第32-33页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第33-52页 |
| 1 实验材料 | 第33-36页 |
| ·菌株和质粒 | 第33-34页 |
| ·分子生物学实验常用酶和试剂(盒) | 第34页 |
| ·常用培养基、试剂、缓冲液配方 | 第34-35页 |
| ·常用培养基配方 | 第34-35页 |
| ·常用试剂配方 | 第35页 |
| ·常用缓冲液配方 | 第35页 |
| ·主要仪器设备 | 第35-36页 |
| 2 实验方法 | 第36-52页 |
| ·TRAIL基因的克隆和鉴定 | 第36-41页 |
| ·质粒制备和纯化 | 第36页 |
| ·引物设计与基因扩增 | 第36-39页 |
| ·TRAIL基因的克隆与测序 | 第39-41页 |
| ·TRAIL基因表达载体的构建及酵母转化 | 第41-46页 |
| ·表达载体(TRAIL／pPICZ_α-A)的构建 | 第41-43页 |
| ·酵母转化(电转化法) | 第43-44页 |
| ·重组菌株PCR鉴定 | 第44-46页 |
| ·重组酵母的SDS-PAGE鉴定 | 第46-48页 |
| ·摇瓶发酵的一般步骤 | 第46页 |
| ·发酵上清液处理 | 第46-47页 |
| ·发酵产物的SDS-PAGE电泳 | 第47-48页 |
| ·重组酵母摇瓶发酵条件的确定 | 第48-49页 |
| ·甲醇诱导周期对蛋白表达的影响 | 第48页 |
| ·pH值对蛋白表达的影响 | 第48页 |
| ·甲醇诱导浓度对蛋白表达的影响 | 第48-49页 |
| ·高表达菌株的筛选 | 第49页 |
| ·Westernblot检测 | 第49-50页 |
| ·SDS-PAGE电泳分离蛋白质 | 第49页 |
| ·转移 | 第49页 |
| ·封闭 | 第49页 |
| ·免疫反应 | 第49-50页 |
| ·酶显色反应 | 第50页 |
| ·阳离子交换柱层析 | 第50页 |
| ·树脂的准备和层析柱的填装 | 第50页 |
| ·样品上柱 | 第50页 |
| ·洗柱 | 第50页 |
| ·目的蛋白的洗脱 | 第50页 |
| ·生物活性检测 | 第50-52页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第52-61页 |
| 1 TRAIL基因的克隆、鉴定和测序 | 第52-53页 |
| ·TRAIL基因的PCR扩增 | 第52页 |
| ·TRAIL基因克隆载体构建及酶切鉴定 | 第52-53页 |
| ·TRAIL基因的测序鉴定 | 第53页 |
| 2 酵母表达载体构建及鉴定 | 第53-54页 |
| ·酵母表达载体pPICZ_α-A-TRAIL的构建 | 第53-54页 |
| 3 酵母的转化和重组酵母的PCR鉴定 | 第54-55页 |
| ·毕赤酵母转化菌株的PCR鉴定 | 第54页 |
| ·毕赤酵母转化菌株的甲醇利用表型鉴定 | 第54-55页 |
| 4 重组酵母的SDS-PAGE鉴定 | 第55页 |
| 5 重组酵母摇瓶发酵条件的确定 | 第55-57页 |
| ·甲醇诱导周期对蛋白表达的影响 | 第55-56页 |
| ·诱导培养基pH值对蛋白表达的影响 | 第56-57页 |
| ·甲醇诱导终浓度对蛋白表达的影响 | 第57页 |
| 6 高表达菌株的筛选 | 第57-59页 |
| 7 Western blot分析 | 第59页 |
| 8 阳离子交换柱层析 | 第59-60页 |
| 9 生物活性检测 | 第60-61页 |
| 第四部分 讨论 | 第61-68页 |
| 1 TRAIL的临床应用前景 | 第61-62页 |
| 2 利用套叠PCR对TRAIL基因进行改造 | 第62页 |
| 3 酵母表达系统的优越性 | 第62-63页 |
| 4 表达载体的选择 | 第63-64页 |
| 5 转化的影响 | 第64页 |
| 6 降低外源蛋白降解的方法 | 第64-65页 |
| 7 SDS-PAGE过程中的注意事项 | 第65-66页 |
| 8 关于MTT比色实验 | 第66页 |
| 9 本研究今后的主要研究任务 | 第66-68页 |
| 第五部分 结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
| 缩略语表 | 第75-76页 |
| 附录 pPICZ_α-A载体图谱 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77页 |