| 摘 要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-11页 |
| 符号对照表 | 第11-12页 |
| 第一章 引 言 | 第12-34页 |
| ·蛋白质折叠研究的历史回顾 | 第12-15页 |
| ·热休克蛋白和分子伴侣 | 第15-25页 |
| ·Hsp70家族 | 第19-21页 |
| ·Chaperonin家族 | 第21-25页 |
| ·小分子热休克蛋白概述 | 第25-32页 |
| ·小分子热休克蛋白的结构特征 | 第25-29页 |
| ·小分子热休克蛋白的分子伴侣活性及其机制 | 第29-31页 |
| ·Hsp16.3的研究进展 | 第31-32页 |
| ·研究问题和内容 | 第32-34页 |
| 第二章 寡聚体解聚是发挥分子伴侣活性的必要条件 | 第34-44页 |
| ·引言 | 第34-35页 |
| ·材料和方法 | 第35-37页 |
| ·实验材料 | 第35页 |
| ·Hsp16.3蛋白的表达和纯化 | 第35-36页 |
| ·制备化学交联的Hsp16.3蛋白 | 第36页 |
| ·圆二色性光谱 | 第36页 |
| ·温度依赖的排阻层析 | 第36-37页 |
| ·非变性孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第37页 |
| ·分子伴侣活性测量 | 第37页 |
| ·ANS结合荧光光谱 | 第37页 |
| ·实验结果 | 第37-43页 |
| ·化学交联并不改变Hsp16.3的天然结构,但抑制了蛋白在高温下的解聚 | 第37-39页 |
| ·化学交联抑制Hsp16.3依赖于温度的分子伴侣活性、寡聚体的动态解聚和疏水区域的暴露 | 第39-43页 |
| ·讨论 | 第43-44页 |
| 第三章 HSP16.3通过调整寡聚体的解聚速度来调节分子伴侣活性 | 第44-60页 |
| ·引言 | 第44页 |
| ·材料和方法 | 第44-47页 |
| ·实验材料 | 第44-45页 |
| ·分子伴侣活性测定 | 第45页 |
| ·排阻层析 | 第45页 |
| ·孔径梯度非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第45页 |
| ·用AlexaFluor350和AlexaFluor430标记Hsp16.3蛋白 | 第45-46页 |
| ·分子内荧光淬灭 | 第46页 |
| ·荧光各向异性测量 | 第46-47页 |
| ·实验结果 | 第47-57页 |
| ·热处理和低浓度的尿素诱导Hsp16.3的活性增加,但寡聚体大小不变 | 第47-50页 |
| ·预热处理和低浓度的尿素使Hsp16.3寡聚体更容易解聚,更加柔韧可变 | 第50-53页 |
| ·Hsp16.3蛋白的寡聚状态依赖于浓度,AlexaFluor350在三聚体中的量子产率高于九聚体 | 第53-55页 |
| ·预热处理和低浓度的尿素提高Hsp16.3寡聚体解聚的表观速率 | 第55-57页 |
| ·讨论 | 第57-60页 |
| ·环境的变化可能使Hsp16.3亚基作用面有细微的调整,并借此调节寡聚体的解聚速度 | 第58页 |
| ·环境依赖的分子伴侣活性使小分子热休克蛋白可以为细胞抵抗胁迫条件提供及时的保护 | 第58-59页 |
| ·小分子热休克蛋白能“记忆”胁迫环境的经历吗?48 | 第59-60页 |
| 第四章 HSP16.3在生理温度范围之内灵活地调控分子伴侣活性 | 第60-76页 |
| ·引言 | 第60页 |
| ·材料和方法 | 第60-62页 |
| ·实验材料 | 第60-61页 |
| ·戊二醛化学交联Hsp16.3蛋白 | 第61页 |
| ·Bis-ANS光交联Hsp16.3蛋白 | 第61页 |
| ·分子伴侣活性、AlexaFluor350和FITC标记Hsp16.3、排阻层析和荧光各向异性检测 | 第61页 |
| ·温度依赖的亚基交换速度测量 | 第61-62页 |
| ·实验结果 | 第62-72页 |
| ·Hsp16.3蛋白在生理温度范围之内灵活调节分子伴侣活性 | 第62-64页 |
| ·Hsp16.3蛋白在稍高温度下更容易和底物形成稳定的复合物,暴露更多的疏水面 | 第64-67页 |
| ·生理温度范围之内,Hsp16.3的寡聚体大小不变,但寡聚体更加柔韧可变 | 第67-70页 |
| ·亚基交换的速度随着温度的升高而增加 | 第70-72页 |
| ·讨论 | 第72-76页 |
| ·小分子热休克蛋白寡聚体动态解聚和发挥活性的机制模型 | 第72-75页 |
| ·Hsp16.3在结核杆菌体内的功能 | 第75-76页 |
| 第五章 HSP16.3 N端区域在结构和活性中的作用 | 第76-101页 |
| ·引言 | 第76-77页 |
| ·材料和方法 | 第77-79页 |
| ·实验材料 | 第77页 |
| ·突变体的构建和蛋白提纯 | 第77页 |
| ·二三级结构比较 | 第77-78页 |
| ·化学交联、孔径梯度凝胶电泳、排阻层析、bis-ANS的光交联、分子伴侣活性测定、Hsp16.3和底物形成复合物的分析 | 第78页 |
| ·trypsin敏感性实验 | 第78页 |
| ·野生型和突变体蛋白之间的亚基交换 | 第78页 |
| ·Bis-ANS 荧光分析 | 第78-79页 |
| ·Bis-ANS结合位点的鉴定 | 第79页 |
| ·实验结果 | 第79-96页 |
| ·突变体的设计和初步结构鉴定 | 第79-82页 |
| ·ΔN35失去了九聚体结构,以三聚体/二聚体形式存在 | 第82-84页 |
| ·野生型蛋白和突变体蛋白能通过亚基交换形成杂合九聚体,其亚基比例为2: | 第84-87页 |
| ·突变体蛋白不能发挥分子伴侣活性 | 第87-91页 |
| ·突变体蛋白不能结合bis-ANS | 第91-94页 |
| ·bis-ANS结合位点的鉴定 | 第94-96页 |
| ·讨论 | 第96-101页 |
| ·Hsp16.3的N端区域是底物结合区域 | 第97-98页 |
| ·至少有三个亚基的N端区域对九聚体组装是非必需的 | 第98-101页 |
| 第六章 保守的IXI/V和LPGV结构单元的研究 | 第101-114页 |
| ·引言 | 第101页 |
| ·材料和方法 | 第101-102页 |
| ·突变体构建和蛋白提纯 | 第101-102页 |
| ·分子伴侣活性、孔径梯度凝胶电泳、排阻层析、化学交联 | 第102页 |
| ·实验结果 | 第102-112页 |
| ·C端尾巴删除突变体的设计和蛋白提纯 | 第102-103页 |
| ·IXI/V结构单元对寡聚体的形成是必需的 | 第103-105页 |
| ·IXI/V结构单元对分子伴侣活性不是必需的,小寡聚体在低温下具有更高的活性,高温下和野生型蛋白相同 | 第105-106页 |
| ·保守的LPGV结构单元突变体的设计 | 第106-108页 |
| ·G59W失去九聚体结构,不能和野生型蛋白形成杂合体 | 第108-111页 |
| ·G59W常温下表现出更强的分子伴侣活性,但高温下和野生型蛋白相当 | 第111-112页 |
| ·讨论 | 第112-114页 |
| ·小寡聚体是小分子热休克蛋白的活性形式,大寡聚体不是活性所必要的 | 第112-113页 |
| ·IXI/V和LPGV结构单元的作用 | 第113-114页 |
| 第七章 分子伴侣蛋白整体构象的柔性和一级序列的关系 | 第114-130页 |
| ·引言 | 第114-115页 |
| ·材料和方法 | 第115-117页 |
| ·材料 | 第115页 |
| ·突变体构建和蛋白提纯 | 第115页 |
| ·准备氧化型的突变体OxG89C和还原型突变体RecG89C | 第115-116页 |
| ·分子伴侣活性检测、排阻层析、ANS荧光、圆二色光谱测量 | 第116页 |
| ·Cys含量的统计分析 | 第116-117页 |
| ·实验结果 | 第117-127页 |
| ·分子伴侣蛋白中Cys的含量显著低于其他蛋白家族 | 第117-120页 |
| ·G89C突变体蛋白的构建和分子伴侣活性鉴定 | 第120-122页 |
| ·二硫键使Hsp16.3不能有效再折叠再组装并形成蛋白聚集 | 第122-124页 |
| ·OxG89C的聚集能被分子伴侣蛋白抑制 | 第124-126页 |
| ·二硫键使Hsp16.3蛋白形成熔球态中间体,并暴露较多的疏水面 | 第126-127页 |
| ·讨论 | 第127-130页 |
| ·分子伴侣蛋白在经历胁迫条件后能自发折叠组装,以便继续发挥活性,而二硫键的缺乏则是这种能力的必要前提 | 第128-129页 |
| ·分子伴侣蛋白能灵活调节其疏水面的暴露,显示出高度的构象柔性 | 第129页 |
| ·分子伴侣的Cys在长期的进化中可能由于负选择的压力被剔除 | 第129-130页 |
| 结论 | 第130-132页 |
| 参考文献 | 第132-142页 |
| 致谢及声明 | 第142-143页 |
| 个人简历、在学期间的研究成果及发表的学术论文 | 第143-144页 |
