| 英文缩略词表 | 第1-8页 |
| 中文摘要 | 第8-11页 |
| 英文摘要 | 第11-15页 |
| 实验流程 | 第15-16页 |
| 前言 | 第16-19页 |
| 第一部分 MAGE-D4 的生物信息学分析 | 第19-39页 |
| 材料与方法 | 第19-21页 |
| 1 实验材料 | 第19页 |
| 2 实验方法 | 第19-21页 |
| ·生物信息学分析数据库及在线软件 | 第19-21页 |
| ·分析步骤 | 第21页 |
| 结果 | 第21-35页 |
| 1 MAGE-D4 核苷酸序列分析 | 第21-24页 |
| ·MAGE-D4 基因基本信息 | 第21-22页 |
| ·MAGE-D4 电子表达谱分析 | 第22-23页 |
| ·MAGE-D4a mRNA 密码子偏好性分析 | 第23-24页 |
| 2 MAGE-D4 蛋白结构与功能分析 | 第24-35页 |
| ·蛋白质同源性分析 | 第24-25页 |
| ·MAGE-D4 蛋白的理化性质 | 第25-27页 |
| ·MAGE-D4 蛋白跨膜信息分析 | 第27-29页 |
| ·MAGE-D4 蛋白信号肽预测 | 第29-31页 |
| ·MAGE-D4 蛋白二级结构预测 | 第31页 |
| ·MAGE-D4 蛋白结构域和功能性位点分析 | 第31-33页 |
| ·MAGE-D4 蛋白亚细胞定位预测 | 第33-34页 |
| ·MAGE-D4 蛋白 T 细胞抗原表位的预测 | 第34-35页 |
| 讨论 | 第35-39页 |
| 第二部分 MAGE-D4 融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定 | 第39-65页 |
| 材料与方法 | 第39-50页 |
| 1 实验材料与仪器设备 | 第39-42页 |
| 2 实验方法 | 第42-50页 |
| ·MAGE-D4 基因体外重组 | 第42-47页 |
| ·引物的设计 | 第42-44页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第44页 |
| ·PCR 产物的纯化 | 第44页 |
| ·pMAL-c2 质粒的扩增及提取 | 第44-46页 |
| ·目的基因的酶切处理 | 第46页 |
| ·质粒的酶切处理 | 第46页 |
| ·目的基因与质粒的连接 | 第46页 |
| ·重组质粒的转化与筛选 | 第46-47页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第47页 |
| ·重组质粒和菌种的保存 | 第47页 |
| ·MAGE-D4 融合蛋白的体外诱导表达 | 第47-49页 |
| ·感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第47-48页 |
| ·MAGE-D4 融合蛋白在 Rosetta(DE3)宿主菌中的表达 | 第48页 |
| ·MAGE-D4 融合蛋白表达形式的确定 | 第48页 |
| ·融合蛋白体外表达条件的优化 | 第48-49页 |
| ·原核表达蛋白的分离纯化及鉴定 | 第49-50页 |
| ·MAGE-D4 融合蛋白的分离纯化 | 第49页 |
| ·MAGE-D4 融合蛋白的透析除盐及冷冻干燥 | 第49页 |
| ·MAGE-D4 融合蛋白的质谱鉴定 | 第49-50页 |
| 结果 | 第50-61页 |
| 1 MAGE-D4 基因体外重组 | 第50-56页 |
| ·PCR 扩增 MAGE-D4 目的基因 | 第50页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第50-56页 |
| 2 MAGE-D4 融合蛋白的体外诱导表达 | 第56-61页 |
| ·融合蛋白在 Rosetta(DE3)宿主菌中的表达 | 第56页 |
| ·MAGE-D4 融合蛋白表达形式的确定 | 第56-57页 |
| ·融合蛋白体外表达条件的优化 | 第57-58页 |
| ·原核表达蛋白的分离纯化及质谱分析 | 第58-61页 |
| 讨论 | 第61-65页 |
| 第三部分 MAGE-D4 多克隆抗体的制备材料与方法 | 第65-74页 |
| 1 实验材料与仪器设备 | 第65-67页 |
| 2 实验方法 | 第67-69页 |
| ·抗原的制备 | 第67页 |
| ·免疫方法 | 第67页 |
| ·抗血清的收集 | 第67页 |
| ·抗血清的纯化与保存 | 第67-68页 |
| ·间接 ELISA 检测抗血清的效价 | 第68页 |
| ·抗血清的免疫印迹检测(Western Blot) | 第68-69页 |
| 结果 | 第69-71页 |
| 1 抗血清的纯化 | 第69-70页 |
| 2 抗血清效价的测定 | 第70-71页 |
| 3 抗血清特异性的检测 | 第71页 |
| 讨论 | 第71-74页 |
| 第四部分 MAGE-D4 基因表达的检测 | 第74-95页 |
| 材料与方法 | 第74-79页 |
| 1 实验材料与仪器设备 | 第74-75页 |
| 2 实验方法 | 第75-79页 |
| ·总 RNA 的提取 | 第75-76页 |
| ·总 RNA 的检测 | 第76-77页 |
| ·cDNA 的合成 | 第77页 |
| ·cDNA 质量的检测 | 第77页 |
| ·MAGE-D4 基因的扩增及电泳鉴定 | 第77-78页 |
| ·免疫组织化学染色 | 第78-79页 |
| ·统计学分析 | 第79页 |
| 结果 | 第79-91页 |
| 1 RNA 质量的检测 | 第79页 |
| 2 cDNA 质量的检测 | 第79-80页 |
| 3 MAGE-D4 mRNA 表达及其与肿瘤临床病理参数关系的分析 | 第80-81页 |
| ·肿瘤组织和肿瘤细胞株中 MAGE-D4 mRNA 表达的检测 | 第80-81页 |
| ·MAGE-D4 mRNA 表达与结直肠癌临床病理参数关系的分析 | 第81页 |
| 4 MAGE-D4 蛋白表达及其与肿瘤临床病理参数关系的分析 | 第81-91页 |
| ·胶质瘤组织中 MAGE-D4 蛋白的表达及意义 | 第81-83页 |
| ·非小细胞肺癌组织中 MAGE-D4 蛋白的表达及意义 | 第83-85页 |
| ·MAGE-D4 蛋白在其他肿瘤组织中的表达 | 第85-91页 |
| 讨论 | 第91-95页 |
| 第五部分 MAGE-D4 抗体血清学检测 | 第95-110页 |
| 材料与方法 | 第95-98页 |
| 1 实验材料与仪器设备 | 第95-96页 |
| 2 实验方法 | 第96-98页 |
| ·Bradford 法测定包被蛋白的浓度 | 第96页 |
| ·间接 ELISA 检测血清中抗 MAGE-D4 抗体的技术流程 | 第96页 |
| ·抗 MAGE-D4 抗体阳性血清的确定 | 第96-97页 |
| ·抗原最适包被浓度和血清最佳稀释度的确定 | 第97页 |
| ·间接 ELISA 具体步骤 | 第97页 |
| ·重复性实验 | 第97-98页 |
| ·阳性结果的判断 | 第98页 |
| ·统计学分析 | 第98页 |
| 结果 | 第98-106页 |
| 1 包被蛋白浓度的测定 | 第98-99页 |
| 2 抗 MAGE-D4 抗体阳性血清的确定 | 第99页 |
| 3 抗原最适包被浓度和血清最佳稀释度的确定 | 第99-102页 |
| 4 血清抗 MAGE-D4 抗体的检测 | 第102-105页 |
| ·正常人血清抗 MAGE-D4 抗体的检测结果 | 第102-103页 |
| ·肿瘤病人血清抗 MAGE-D4 抗体的检测结果 | 第103-105页 |
| ·胶质瘤 MAGE-D4 表达与血清抗体存在的情况 | 第105页 |
| ·MAGE-D4 抗体与胶质瘤临床病理参数关系的分析 | 第105页 |
| 5 重复性实验 | 第105-106页 |
| 讨论 | 第106-110页 |
| 全文小结 | 第110-111页 |
| 创新性的自我评价 | 第111页 |
| 问题和展望 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-120页 |
| 综述 | 第120-148页 |
| 致谢 | 第148-149页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第149页 |
