| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第9-16页 |
| 1.1 甾体化合物的结构和功能 | 第9-10页 |
| 1.1.1 甾体化合物的结构 | 第9页 |
| 1.1.2 甾体化合物的种类和功能 | 第9-10页 |
| 1.2. 甾体微生物转化的发现和发展 | 第10-11页 |
| 1.3 甾体化合物微生物转化的特点 | 第11页 |
| 1.4 甾体化合物微生物转化的类型 | 第11-12页 |
| 1.5 甾体羟化酶的结构、作用机理及研究进展 | 第12-13页 |
| 1.6 甾体微生物转化11β-羟基化 | 第13-14页 |
| 1.7 工业上生产氢化可的松的现状 | 第14页 |
| 1.8 甾体羟化酶的克隆鉴定 | 第14页 |
| 1.9 本研究内容及意义 | 第14-16页 |
| 1.9.1 研究目的 | 第14-15页 |
| 1.9.2 研究内容 | 第15页 |
| 1.9.3 研究意义 | 第15-16页 |
| 2 材料和方法 | 第16-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第16-21页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第16页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第16-18页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第18-19页 |
| 2.1.4 主要溶液与缓冲液 | 第19-20页 |
| 2.1.5 培养基与抗生素 | 第20页 |
| 2.1.6 甾体底物与试剂 | 第20-21页 |
| 2.2 实验方法 | 第21-36页 |
| 2.2.1 蓝色犁头霉孢子悬液的制备 | 第21页 |
| 2.2.2 蓝色犁头霉羟化酶活性诱导实验 | 第21-22页 |
| 2.2.3 蓝色犁头霉(Absidia coerulea)基因组DNA、总RNA的提取、纯化和cDNA的合成 | 第22-24页 |
| 2.2.4 蓝色犁头霉转录组测序信息分析 | 第24-26页 |
| 2.2.5 目标基因的克隆 | 第26-30页 |
| 2.2.6 酿酒酵母表达载体pYES Ⅱ-CYP的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.7 酿酒酵母电转化方法 | 第31-32页 |
| 2.2.8 酵母转化子的筛选与鉴定 | 第32页 |
| 2.2.9 重组酵母菌的培养及其甾体转化 | 第32页 |
| 2.2.10 CYP5311B2基因在蓝色犁头霉的敲除 | 第32-36页 |
| 3 结果与讨论 | 第36-50页 |
| 3.1 蓝色犁头霉甾体11β-羟化酶诱导实验 | 第36页 |
| 3.2 蓝色犁头霉总RNA的提取 | 第36-37页 |
| 3.3 cDNA的合成及验证 | 第37-38页 |
| 3.4 蓝色犁头霉细胞色素P450酶基因的荧光定量PCR分析 | 第38页 |
| 3.5 CYP-7、CYP-8基因的扩增、克隆及测序 | 第38-39页 |
| 3.6 重组酿酒酵母表达载体的构建 | 第39-41页 |
| 3.7 重组酿酒酵母表达载体的转化及转化子筛选 | 第41-42页 |
| 3.8 重组酿酒酵母甾体11α-羟化活性的检测 | 第42-46页 |
| 3.8.1 重组酿酒酵母转化产物薄层层析分析 | 第42-43页 |
| 3.8.2 CYP-7重组酿酒酵母转化产物高效液相色谱分析 | 第43-46页 |
| 3.9 CYP-7基因的生物信息学分析 | 第46-47页 |
| 3.9.1 CYP-7基因核苷酸序列分析 | 第46页 |
| 3.9.2 CYP5311B2氨基酸序列分析 | 第46-47页 |
| 3.9.3 CYP5311B2的进化树分析 | 第47页 |
| 3.10 CYP5311B2基因的定向敲除 | 第47-50页 |
| 3.10.1 敲除载体的构建 | 第48-49页 |
| 3.10.2 蓝色犁头霉CYP5311B2基因敲除突变株的筛选 | 第49-50页 |
| 4 结论 | 第50-51页 |
| 5 展望 | 第51-52页 |
| 6 参考文献 | 第52-58页 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第58-59页 |
| 8 致谢 | 第59页 |
