| 摘要 | 第4-7页 |
| abstract | 第7-9页 |
| 英文缩写词索引 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-16页 |
| 第一章 靶向CD19 CAR的 PiggyBac重组载体构建及鉴定 | 第16-31页 |
| 1、材料 | 第16-19页 |
| 1.1 主要实验试剂 | 第16-17页 |
| 1.2 主要实验仪器 | 第17-18页 |
| 1.3 细胞的复苏、培养及冻存 | 第18-19页 |
| 1.4 载体 | 第19页 |
| 2、方法 | 第19-29页 |
| 2.1 构建PiggyBac重组载体 | 第19-24页 |
| 2.1.1 载体酶切线性化 | 第19-20页 |
| 2.1.2 DNA琼脂凝胶电泳 | 第20页 |
| 2.1.3 胶回收试剂盒收回线性化PiggyBac转座子载体 | 第20-21页 |
| 2.1.4 CD19CAR基因片段PCR、酶切处理 | 第21-22页 |
| 2.1.5 将线性转座子载体PB513B-1与CD19CAR无缝连接 | 第22页 |
| 2.1.6 连接产物pb19CAR的转化 | 第22-23页 |
| 2.1.7 连接产物pb19CAR的扩增 | 第23页 |
| 2.1.8 质粒提取 | 第23-24页 |
| 2.2 酶切鉴定重组载体 | 第24-25页 |
| 2.3 Western blot鉴定CD19CAR表达 | 第25-29页 |
| 3、结果 | 第29-31页 |
| 3.1 重组载体pb19CAR构建成功 | 第29-31页 |
| 第二章 原代T细胞基因转导的优化 | 第31-44页 |
| 1、材料 | 第31-32页 |
| 1.1 主要实验试剂 | 第31页 |
| 1.2 主要实验仪器 | 第31-32页 |
| 1.3 细胞培养 | 第32页 |
| 1.4 载体 | 第32页 |
| 2、方法 | 第32-37页 |
| 2.1 Ficoll密度梯度法分离外周血单个核细胞 | 第32-33页 |
| 2.2 Celetrix电穿孔仪转导原代T细胞 | 第33-34页 |
| 2.3 Nucleofector~(TM)2b核转仪转染原代T细胞 | 第34页 |
| 2.4 慢病毒的制备及转染激活后的T细胞 | 第34-37页 |
| 2.5 流式细胞术检测基因转导24 小时及12 天后CD19CAR的表达 | 第37页 |
| 2.6 统计学方法 | 第37页 |
| 3、结果 | 第37-44页 |
| 3.1 电穿孔仪T细胞转导效率及细胞活率较高 | 第37-41页 |
| 3.2 PiggyBac转座酶是提高转座子系统转座效率的关键 | 第41-44页 |
| 第三章 CAR-T细胞体外激活扩增后CD19CAR的表达及细胞表型 | 第44-49页 |
| 1、材料 | 第44-46页 |
| 1.1 主要实验试剂 | 第44页 |
| 1.2 主要实验仪器 | 第44-45页 |
| 1.3 细胞培养 | 第45-46页 |
| 2、方法 | 第46页 |
| 2.1 流式细胞术检测激活扩增12 天后CD19CAR的表达及细胞表型 | 第46页 |
| 3、结果 | 第46-49页 |
| 3.1 靶抗原CD19 蛋白可优势扩增CAR-T细胞 | 第46-47页 |
| 3.2 混合细胞因子利于早期记忆T细胞的生长 | 第47-49页 |
| 讨论 | 第49-52页 |
| 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 综述 PiggyBac转座子及在CAR-T细胞免疫治疗中应用的研究进展 | 第56-67页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 附录 个人简历、在校期间发表论文 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
