| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 前言 | 第10-21页 |
| 1.1 塑化剂概况及毒性研究 | 第10-18页 |
| 1.1.1 DEHP的性质与应用 | 第11-12页 |
| 1.1.2 DEHP的吸收与代谢 | 第12-13页 |
| 1.1.3 DEHP在人群中的污染情况 | 第13-14页 |
| 1.1.4 DEHP毒性的研究现状 | 第14-18页 |
| 1.2 RNA干扰技术及其应用 | 第18页 |
| 1.3 类固醇合成急性调节蛋白(StAR) | 第18-19页 |
| 1.4 研究的目的与意义 | 第19-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-41页 |
| 2.1 实验材料与仪器 | 第21-25页 |
| 2.1.1 细胞及质粒 | 第21页 |
| 2.1.2 主要试剂和试剂盒 | 第21-23页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2.1.4 培养基和主要试剂配制 | 第24-25页 |
| 2.2 StARRNAi慢病毒载体的构建 | 第25-29页 |
| 2.2.1 设计合成3对StAR-shRNA | 第25-26页 |
| 2.2.2 StAR-shRNA制备 | 第26页 |
| 2.2.3 慢病毒干扰载体构建 | 第26-29页 |
| 2.3 StAR高表达慢病毒载体的构建 | 第29-30页 |
| 2.3.1 StAR基因引物的设计 | 第29页 |
| 2.3.2 PCR扩增反应 | 第29-30页 |
| 2.3.3 PCR产物回收 | 第30页 |
| 2.3.4 StAR基因慢病毒表达载体的构建 | 第30页 |
| 2.4 干扰StAR-shRNA的筛选 | 第30-32页 |
| 2.4.1 质粒载体转染293细胞 | 第30-31页 |
| 2.4.2 提取各组细胞的总RNA | 第31页 |
| 2.4.3 RNA反转录为cDNA | 第31-32页 |
| 2.4.4 检测StAR基因相对表达量 | 第32页 |
| 2.5 RNAi慢病毒的包装 | 第32-33页 |
| 2.5.1 培养293T细胞包装慢病毒 | 第32-33页 |
| 2.5.2 慢病毒的浓缩纯化 | 第33页 |
| 2.5.3 慢病毒的滴度测定 | 第33页 |
| 2.6 高表达慢病毒的包装 | 第33-34页 |
| 2.6.1 培养293T细胞包装慢病毒 | 第33页 |
| 2.6.2 高表达慢病毒的滴度测定 | 第33-34页 |
| 2.7 StAR基因沉默细胞和高表达细胞株的构建 | 第34页 |
| 2.8 鉴定构建的细胞 | 第34-36页 |
| 2.8.1 QPCR引物的设计 | 第34-35页 |
| 2.8.2 标准曲线和熔解曲线的建立 | 第35页 |
| 2.8.3 构建细胞株各目的基因的表达水平检测 | 第35页 |
| 2.8.4 Westernblot鉴定 | 第35-36页 |
| 2.9 DEHP处理对MCF-7细胞和StAR沉默或StAR高表达细胞株 | 第36-40页 |
| 2.9.1 QPCR检测基因表达变化 | 第36-38页 |
| 2.9.2 Westernblot检测蛋白表达变化 | 第38-40页 |
| 2.10 统计方法 | 第40-41页 |
| 第三章 结果 | 第41-61页 |
| 3.1 StAR基因沉默细胞和高表达细胞株的构建 | 第41-45页 |
| 3.1.1 慢病毒载体测序鉴定结果 | 第41页 |
| 3.1.2 沉默细胞总RNA纯度和完整性 | 第41页 |
| 3.1.3 高表达PCR扩增结果 | 第41-42页 |
| 3.1.4 RNAi慢病毒载体的干扰效率 | 第42-43页 |
| 3.1.5 病毒滴度检测 | 第43-45页 |
| 3.2 StAR基因沉默细胞和高表达细胞株的鉴定 | 第45-48页 |
| 3.2.1 StAR基因QPCR条件探索及标准曲线的建立 | 第45-46页 |
| 3.2.2 QPCR检测各细胞目的基因的表达水平 | 第46-47页 |
| 3.2.3 Westernblot鉴定各构建细胞株 | 第47-48页 |
| 3.3 DEHP对MCF-7细胞和StAR沉默或StAR高表达细胞株的影响 | 第48-61页 |
| 3.3.1 QPCR条件探索及标准曲线的建立 | 第48-49页 |
| 3.3.2 DEHP处理各细胞后的形态学变化 | 第49-50页 |
| 3.3.3 目的基因的表达水平变化 | 第50-52页 |
| 3.3.4 目的蛋白的表达水平变化 | 第52-61页 |
| 第四章 讨论 | 第61-66页 |
| 4.1 构建细胞株的基础建立 | 第61-62页 |
| 4.2 高效构建两种细胞株 | 第62页 |
| 4.3 StAR基因作用讨论 | 第62-66页 |
| 第五章 结论 | 第66-68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 附录 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第74页 |
