| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第10-21页 |
| 1.1 反式-4-羟基-L-脯氨酸简介 | 第10页 |
| 1.2 羟脯氨酸在体内的生理代谢过程及其生理功能 | 第10-12页 |
| 1.2.1 羟脯氨酸在哺乳动物体内的代谢 | 第10-11页 |
| 1.2.2 羟脯氨酸在微生物体内的代谢 | 第11-12页 |
| 1.3 羟脯氨酸的应用价值 | 第12-14页 |
| 1.3.1 在医药方面的应用 | 第12-13页 |
| 1.3.2 在美容方面的应用 | 第13页 |
| 1.3.3 在食品方面的应用 | 第13页 |
| 1.3.4 在生物化工方面的应用 | 第13页 |
| 1.3.5 检测羟脯氨酸对于医药及食品方面的重要作用 | 第13-14页 |
| 1.4 羟脯氨酸的生产方法 | 第14-15页 |
| 1.4.1 蛋白水解法生产羟脯氨酸 | 第14-15页 |
| 1.4.2 生物酶法生产羟脯氨酸 | 第15页 |
| 1.5 羟脯氨酸的检测方法 | 第15-16页 |
| 1.5.1 传统比色法 | 第15-16页 |
| 1.5.2 氨基酸自动分析法 | 第16页 |
| 1.5.3 高效液相色谱法 | 第16页 |
| 1.5.4 毛细管电泳法(CE) | 第16页 |
| 1.6 脯氨酸羟化酶P4H的基本性质 | 第16-17页 |
| 1.7 国内外羟脯氨酸的研究现状 | 第17-18页 |
| 1.8 本课题的研究意义及内容 | 第18-21页 |
| 第2章 材料与方法 | 第21-33页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-24页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第21-22页 |
| 2.1.2 主要的试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 | 第22-23页 |
| 2.1.4 培养基 | 第23页 |
| 2.1.5 其他溶液的配置 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-33页 |
| 2.2.1 脯氨酸-4-羟化酶基因(p4h)的克隆 | 第24-25页 |
| 2.2.2 Dactylosporangium sp.的脯氨酸-4-羟化酶基因的全基因合成 | 第25页 |
| 2.2.3 聚合酶链式反应(PCR)的体系及条件 | 第25-26页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶核酸电泳 | 第26页 |
| 2.2.5 DNA片段胶回收 | 第26页 |
| 2.2.6 构建表达P4H酶的重组大肠杆菌 | 第26-28页 |
| 2.2.6.1 大肠杆菌感受态细胞制作(冰上无菌条件) | 第26页 |
| 2.2.6.2 目的片段与T载体连接 | 第26-27页 |
| 2.2.6.3 连接产物转入大肠杆菌感受态细胞 | 第27页 |
| 2.2.6.4 质粒抽提 | 第27页 |
| 2.2.6.5 酶切及连接体系和条件 | 第27-28页 |
| 2.2.7 构建表达P4H酶的重组谷氨酸棒杆菌 | 第28-29页 |
| 2.2.7.1 酶切及连接体系和条件 | 第28页 |
| 2.2.7.2 谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备 | 第28页 |
| 2.2.7.3 谷氨酸棒杆菌的电转化 | 第28-29页 |
| 2.2.8 重组菌的培养诱导及蛋白表达 | 第29页 |
| 2.2.9 启动子替换方案 | 第29页 |
| 2.2.10 载体pEC-XK99E及合成启动子酶切 | 第29-30页 |
| 2.2.11 载体pEC-XK99E及PcspB双酶切 | 第30页 |
| 2.2.12 羟脯氨酸及脯氨酸的测定方法 | 第30-32页 |
| 2.2.12.1 氯胺T氧化比色法测定羟脯氨酸 | 第30-31页 |
| 2.2.12.2 酸式茚三酮比色法测定L-脯氨酸 | 第31页 |
| 2.2.12.3 纸层析法定性L-脯氨酸和4-羟脯氨酸 | 第31-32页 |
| 2.2.12.4 液质联用测定发酵液中的羟脯氨酸 | 第32页 |
| 2.2.12.5 P4H酶活的测定 | 第32页 |
| 2.2.13 重组菌摇瓶发酵条件的研究 | 第32页 |
| 2.2.13.1 L-脯氨酸的添加量对产量的影响 | 第32页 |
| 2.2.13.2 酵母粉(YE)和玉米浆对产量的影响 | 第32页 |
| 2.2.14 重组菌质粒稳定性的研究 | 第32-33页 |
| 第3章 结果与讨论 | 第33-51页 |
| 3.1 不同来源的p4h的克隆 | 第33-34页 |
| 3.2 表达脯氨酸-4-羟化酶的重组菌的构建 | 第34-43页 |
| 3.2.1 表达脯氨酸-4-羟化酶的大肠杆菌重组菌的构建 | 第36-40页 |
| 3.2.2 表达脯氨酸-4-羟化酶的谷氨酸棒杆菌重组菌的构建 | 第40-41页 |
| 3.2.3 脯氨酸-4-羟化酶的表达 | 第41-43页 |
| 3.3 启动子的替换 | 第43页 |
| 3.4 重组菌的酶活 | 第43-45页 |
| 3.5 羟脯氨酸的产物鉴定 | 第45-46页 |
| 3.5.1 纸层析法 | 第45页 |
| 3.5.2 树脂分离后液质联用测定 | 第45-46页 |
| 3.6 重组菌摇瓶发酵结果 | 第46-47页 |
| 3.7 重组菌摇瓶发酵的初步优化 | 第47-49页 |
| 3.7.1 添加YE和玉米浆对Hyp产量的影响 | 第47-48页 |
| 3.7.2 L-脯氨酸添加量对Hyp产量的影响 | 第48-49页 |
| 3.8 重组菌稳定性的研究 | 第49页 |
| 3.9 本章小结 | 第49-51页 |
| 第4章 结论与展望 | 第51-53页 |
| 4.1 论文总结 | 第51页 |
| 4.2 展望 | 第51-53页 |
| 参考文献 | 第53-59页 |
| 附录 | 第59-64页 |
| 科研成果 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
