中文摘要 | 第3-5页 |
ABSTRACT | 第5-6页 |
缩略词表 | 第7-13页 |
第一章 文献综述 | 第13-38页 |
1 转录组研究概述 | 第13-14页 |
2 MICRORNA研究进展 | 第14-27页 |
2.1 MIRNA的发现 | 第16页 |
2.2 MIRNA的生物合成特点 | 第16-17页 |
2.3 MiRNA作用机制 | 第17-18页 |
2.4 SIRNA和MIRNA | 第18-19页 |
2.5 MIRNA的检测手段 | 第19-21页 |
2.5.1 Northern印迹分析(Northern Analysis) | 第19页 |
2.5.2 微点阵(Microarray)分析 | 第19-20页 |
2.5.3 定量实时PCR (Quantitative Real-time PCR) | 第20页 |
2.5.4 miRNA测序技术 | 第20-21页 |
2.6 MIRNA介导的病毒与宿主互相作用 | 第21-24页 |
2.6.1 病毒编码miRNA对自身的作用 | 第21-22页 |
2.6.2 病毒编码miRNA对宿主目标基因的作用 | 第22-23页 |
2.6.3 宿主编码miRNA对自身的影响 | 第23页 |
2.6.4 宿主编码miRNA对病毒感染进程的影响 | 第23-24页 |
2.7 MIRNA与免疫 | 第24-25页 |
2.8 MIRNA与长链非编码RNA | 第25-26页 |
2.9 MIRNA研究展望 | 第26-27页 |
3 PCMV研究进展 | 第27-38页 |
3.1 猪巨细胞病毒的概述 | 第27-28页 |
3.2 猪巨细胞病毒(PCMV)病原学 | 第28-29页 |
3.3 PCMV基因组 | 第29-32页 |
3.4 流行病学 | 第32-33页 |
3.5 PCMV的发病机理、临床症状与病理变化 | 第33-34页 |
3.6 PCMV检测技术研究进展 | 第34-37页 |
3.6.1 病理组织切片 | 第34页 |
3.6.2 间接荧光抗体技术 | 第34页 |
3.6.3 原位杂交技术和免疫组织化学技术 | 第34-35页 |
3.6.4 PCR | 第35页 |
3.6.5 ELISA | 第35-37页 |
3.7 PCMV的防治 | 第37-38页 |
第二章 猪巨细胞病毒感染猪胸腺的转录组 | 第38-67页 |
1 主要试剂与材料 | 第39-40页 |
1.1 基因芯片 | 第39页 |
1.2 RNA样品制备试剂盒及试剂 | 第39页 |
1.3 TOTAL RNA整理和RNA质量检测试剂盒及试剂 | 第39页 |
1.4 标签反应准备试剂盒 | 第39页 |
1.5 杂交反应试剂盒及材料 | 第39页 |
1.6 基因芯片清洗试剂盒与材料 | 第39-40页 |
1.7 反转录反应试剂 | 第40页 |
1.8 其他设备 | 第40页 |
1.9 动物、病毒、血清 | 第40页 |
2 实验方法 | 第40-50页 |
2.1 动物、病毒准备 | 第40-41页 |
2.2 PCMV感染检测 | 第41-42页 |
2.3 转录组芯片测定前准备 | 第42-46页 |
2.3.1 组织总RNA样品准备 | 第42页 |
2.3.2 RNA质量检测 | 第42-43页 |
2.3.3 RNA标记反应 | 第43-44页 |
2.3.4 标记/扩增的RNA的纯化和标记cDNA的质量控制 | 第44页 |
2.3.5 杂交 | 第44-45页 |
2.3.6 基因芯片洗涤与扫描 | 第45-46页 |
2.4 芯片数据分析 | 第46-47页 |
2.5 RT-QPCR验证差异性表达基因水平 | 第47-50页 |
2.5.1 cDNA合成 | 第47页 |
2.5.2 制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板 | 第47-48页 |
2.5.3 qPCR反应 | 第48-49页 |
2.5.4 计算 | 第49页 |
2.5.5 Westem blot analysis | 第49-50页 |
3 实验结果 | 第50-62页 |
3.1 组织感染PCMV的确认 | 第50-52页 |
3.2 PCMV感染猪胸腺转录组分析 | 第52-59页 |
3.3 STRING分析 | 第59-61页 |
3.4 转录组芯片的QPCR和WESTERN BLOT验证试验 | 第61-62页 |
4 讨论 | 第62-66页 |
5 结论 | 第66-67页 |
第三章 猪巨细胞病毒感染猪器官的MIRNA 表达谱高通量测序 | 第67-91页 |
1 实验材料 | 第67页 |
1.1 动物、菌株、细胞与病毒 | 第67页 |
1.2 试剂 | 第67页 |
1.3 仪器设备 | 第67页 |
2 实验方法 | 第67-72页 |
2.1 病毒接种与动物模型 | 第67-68页 |
2.2 RNA抽取 | 第68-69页 |
2.2.1 组织总RNA样品准备 | 第68页 |
2.2.2 RNA质量检测 | 第68-69页 |
2.3 数据来源 | 第69页 |
2.4 小片段RNA文库构建与高通量测序 | 第69-70页 |
2.5 MIRNA-SEQ数据分析 | 第70-71页 |
2.6 STEM-LOOp RT-PCR | 第71-72页 |
2.6.1 相对定量PCR反应体系 | 第71页 |
2.6.2 加样 | 第71页 |
2.6.3 RT-qPCR反应循环 | 第71-72页 |
3 实验结果 | 第72-86页 |
3.1 样品RNA质量控制 | 第72页 |
3.2 测序文库质量检测 | 第72-73页 |
3.3 SOLEXA高通量测序数据 | 第73-77页 |
3.4 宿主编码MIRNA表达谱分析 | 第77页 |
3.5 显著差异性表达的宿主编码MIRNA | 第77-79页 |
3.6 差异性表达MIRNA表达的确认 | 第79-80页 |
3.7 差异性表达MIRNAs靶基因预测与靶基因功能富集分析 | 第80-84页 |
3.8 差异性表达MiRNAs与靶MRNAs在PCMV感染时的综合表达分析 | 第84-86页 |
4 讨论 | 第86-90页 |
5 结论 | 第90-91页 |
第四章 差异性表达MIRNAS对靶基因的调控 | 第91-116页 |
1 实验材料 | 第91-92页 |
1.1 仪器与设备 | 第91页 |
1.2 细胞与试剂 | 第91-92页 |
2 实验方法 | 第92-102页 |
2.1 表达目的MIRNAs的PSRL-SIH1-H1-GFP载体建立 | 第92-94页 |
2.2 慢病毒包装 | 第94-95页 |
2.3 慢病毒浓缩与纯化 | 第95页 |
2.4 慢病毒滴度测定 | 第95页 |
2.5 表达miRNA的慢病毒载体感染猪巨噬细胞 | 第95页 |
2.6 RT-PCR检测miRNAs在巨噬细胞中各时间点的表达 | 第95-98页 |
2.6.1 细胞RNA提取 | 第96页 |
2.6.2 RT制备cDNA | 第96-97页 |
2.6.3 qPCR反应 | 第97-98页 |
2.7 ELISA及WESTERN BLOT ANALYSIS对免疫相关基因的表达检测 | 第98-102页 |
2.7.1 ELISA检测IL-1α表达 | 第98-99页 |
2.7.2 ELISA检测IL-12表达 | 第99页 |
2.7.3 ELISA检测IL-15表达 | 第99-100页 |
2.7.4 Western-blot检测细胞因子的表达 | 第100-102页 |
3 实验结果 | 第102-110页 |
3.1 PSRL-SIH1-H1-GFP载体的构建 | 第102-103页 |
3.2 慢病毒包装与病毒滴度测定 | 第103-105页 |
3.3 慢病毒感染猪巨噬细胞 | 第105-110页 |
4 讨论 | 第110-114页 |
5 结论 | 第114-116页 |
全文总结 | 第116-118页 |
参考文献 | 第118-133页 |
致谢 | 第133-134页 |
攻读学位期间发表或参与发表的文章及专利 | 第134-139页 |
附录一 | 第139-144页 |
附录二 | 第144-157页 |
附录三 | 第157-181页 |