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猪巨细胞病毒感染猪多器官microRNA表达谱的研究

中文摘要第3-5页
ABSTRACT第5-6页
缩略词表第7-13页
第一章 文献综述第13-38页
    1 转录组研究概述第13-14页
    2 MICRORNA研究进展第14-27页
        2.1 MIRNA的发现第16页
        2.2 MIRNA的生物合成特点第16-17页
        2.3 MiRNA作用机制第17-18页
        2.4 SIRNA和MIRNA第18-19页
        2.5 MIRNA的检测手段第19-21页
            2.5.1 Northern印迹分析(Northern Analysis)第19页
            2.5.2 微点阵(Microarray)分析第19-20页
            2.5.3 定量实时PCR (Quantitative Real-time PCR)第20页
            2.5.4 miRNA测序技术第20-21页
        2.6 MIRNA介导的病毒与宿主互相作用第21-24页
            2.6.1 病毒编码miRNA对自身的作用第21-22页
            2.6.2 病毒编码miRNA对宿主目标基因的作用第22-23页
            2.6.3 宿主编码miRNA对自身的影响第23页
            2.6.4 宿主编码miRNA对病毒感染进程的影响第23-24页
        2.7 MIRNA与免疫第24-25页
        2.8 MIRNA与长链非编码RNA第25-26页
        2.9 MIRNA研究展望第26-27页
    3 PCMV研究进展第27-38页
        3.1 猪巨细胞病毒的概述第27-28页
        3.2 猪巨细胞病毒(PCMV)病原学第28-29页
        3.3 PCMV基因组第29-32页
        3.4 流行病学第32-33页
        3.5 PCMV的发病机理、临床症状与病理变化第33-34页
        3.6 PCMV检测技术研究进展第34-37页
            3.6.1 病理组织切片第34页
            3.6.2 间接荧光抗体技术第34页
            3.6.3 原位杂交技术和免疫组织化学技术第34-35页
            3.6.4 PCR第35页
            3.6.5 ELISA第35-37页
        3.7 PCMV的防治第37-38页
第二章 猪巨细胞病毒感染猪胸腺的转录组第38-67页
    1 主要试剂与材料第39-40页
        1.1 基因芯片第39页
        1.2 RNA样品制备试剂盒及试剂第39页
        1.3 TOTAL RNA整理和RNA质量检测试剂盒及试剂第39页
        1.4 标签反应准备试剂盒第39页
        1.5 杂交反应试剂盒及材料第39页
        1.6 基因芯片清洗试剂盒与材料第39-40页
        1.7 反转录反应试剂第40页
        1.8 其他设备第40页
        1.9 动物、病毒、血清第40页
    2 实验方法第40-50页
        2.1 动物、病毒准备第40-41页
        2.2 PCMV感染检测第41-42页
        2.3 转录组芯片测定前准备第42-46页
            2.3.1 组织总RNA样品准备第42页
            2.3.2 RNA质量检测第42-43页
            2.3.3 RNA标记反应第43-44页
            2.3.4 标记/扩增的RNA的纯化和标记cDNA的质量控制第44页
            2.3.5 杂交第44-45页
            2.3.6 基因芯片洗涤与扫描第45-46页
        2.4 芯片数据分析第46-47页
        2.5 RT-QPCR验证差异性表达基因水平第47-50页
            2.5.1 cDNA合成第47页
            2.5.2 制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板第47-48页
            2.5.3 qPCR反应第48-49页
            2.5.4 计算第49页
            2.5.5 Westem blot analysis第49-50页
    3 实验结果第50-62页
        3.1 组织感染PCMV的确认第50-52页
        3.2 PCMV感染猪胸腺转录组分析第52-59页
        3.3 STRING分析第59-61页
        3.4 转录组芯片的QPCR和WESTERN BLOT验证试验第61-62页
    4 讨论第62-66页
    5 结论第66-67页
第三章 猪巨细胞病毒感染猪器官的MIRNA 表达谱高通量测序第67-91页
    1 实验材料第67页
        1.1 动物、菌株、细胞与病毒第67页
        1.2 试剂第67页
        1.3 仪器设备第67页
    2 实验方法第67-72页
        2.1 病毒接种与动物模型第67-68页
        2.2 RNA抽取第68-69页
            2.2.1 组织总RNA样品准备第68页
            2.2.2 RNA质量检测第68-69页
        2.3 数据来源第69页
        2.4 小片段RNA文库构建与高通量测序第69-70页
        2.5 MIRNA-SEQ数据分析第70-71页
        2.6 STEM-LOOp RT-PCR第71-72页
            2.6.1 相对定量PCR反应体系第71页
            2.6.2 加样第71页
            2.6.3 RT-qPCR反应循环第71-72页
    3 实验结果第72-86页
        3.1 样品RNA质量控制第72页
        3.2 测序文库质量检测第72-73页
        3.3 SOLEXA高通量测序数据第73-77页
        3.4 宿主编码MIRNA表达谱分析第77页
        3.5 显著差异性表达的宿主编码MIRNA第77-79页
        3.6 差异性表达MIRNA表达的确认第79-80页
        3.7 差异性表达MIRNAs靶基因预测与靶基因功能富集分析第80-84页
        3.8 差异性表达MiRNAs与靶MRNAs在PCMV感染时的综合表达分析第84-86页
    4 讨论第86-90页
    5 结论第90-91页
第四章 差异性表达MIRNAS对靶基因的调控第91-116页
    1 实验材料第91-92页
        1.1 仪器与设备第91页
        1.2 细胞与试剂第91-92页
    2 实验方法第92-102页
        2.1 表达目的MIRNAs的PSRL-SIH1-H1-GFP载体建立第92-94页
        2.2 慢病毒包装第94-95页
        2.3 慢病毒浓缩与纯化第95页
        2.4 慢病毒滴度测定第95页
        2.5 表达miRNA的慢病毒载体感染猪巨噬细胞第95页
        2.6 RT-PCR检测miRNAs在巨噬细胞中各时间点的表达第95-98页
            2.6.1 细胞RNA提取第96页
            2.6.2 RT制备cDNA第96-97页
            2.6.3 qPCR反应第97-98页
        2.7 ELISA及WESTERN BLOT ANALYSIS对免疫相关基因的表达检测第98-102页
            2.7.1 ELISA检测IL-1α表达第98-99页
            2.7.2 ELISA检测IL-12表达第99页
            2.7.3 ELISA检测IL-15表达第99-100页
            2.7.4 Western-blot检测细胞因子的表达第100-102页
    3 实验结果第102-110页
        3.1 PSRL-SIH1-H1-GFP载体的构建第102-103页
        3.2 慢病毒包装与病毒滴度测定第103-105页
        3.3 慢病毒感染猪巨噬细胞第105-110页
    4 讨论第110-114页
    5 结论第114-116页
全文总结第116-118页
参考文献第118-133页
致谢第133-134页
攻读学位期间发表或参与发表的文章及专利第134-139页
附录一第139-144页
附录二第144-157页
附录三第157-181页

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