| 中文摘要 | 第4-7页 |
| abstract | 第7-10页 |
| 英文缩略词表 | 第17-18页 |
| 第1章 绪论 | 第18-32页 |
| 1.1 免疫毒素 | 第19-20页 |
| 1.1.1 免疫毒素的靶向结构域 | 第19页 |
| 1.1.2 毒素结构域 | 第19-20页 |
| 1.2 ONCONASE的来源及结构 | 第20-23页 |
| 1.2.1 北美豹蛙 | 第20页 |
| 1.2.2 Onconase的发现 | 第20-21页 |
| 1.2.3 Onconase的结构 | 第21-22页 |
| 1.2.4 Onconase的性质 | 第22页 |
| 1.2.5 Onconase的核糖核酸酶活性 | 第22-23页 |
| 1.2.6 Onconase的抗肿瘤作用 | 第23页 |
| 1.3 趋化因子及其受体 | 第23-27页 |
| 1.3.1 趋化因子的命名 | 第24页 |
| 1.3.2 趋化因子的分类 | 第24-25页 |
| 1.3.3 CXC类趋化因子及定位 | 第25-26页 |
| 1.3.4 CXCR4 | 第26-27页 |
| 1.3.5 V3的来源 | 第27页 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统 | 第27-30页 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达菌株 | 第27-28页 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达载体 | 第28-29页 |
| 1.4.3 启动子 | 第29页 |
| 1.4.4 信号肽 | 第29-30页 |
| 1.4.5 发酵策略 | 第30页 |
| 1.5 重组免疫毒素ONC-V3的设计 | 第30-32页 |
| 第2章 ONCONASE- V3毕赤酵母分泌表达体系的建立 | 第32-54页 |
| 2.1 材料和方法 | 第32-45页 |
| 2.1.1 仪器及设备 | 第32页 |
| 2.1.2 实验材料 | 第32-34页 |
| 2.1.3 酵母表达质粒pGAPZαA-Pre-Onconase-V3的构建 | 第34-36页 |
| 2.1.4 pGAPZαA-Onc-V3转化毕赤酵母X-33 | 第36-37页 |
| 2.1.5 高拷贝转化子的获得 | 第37-38页 |
| 2.1.6 高拷贝转化子的摇瓶发酵 | 第38页 |
| 2.1.7 表达产物Tricine电泳分析 | 第38-39页 |
| 2.1.8 重组子遗传稳定性研究 | 第39页 |
| 2.1.9 酵母染色体DNA的提取 | 第39-40页 |
| 2.1.10 PCR鉴定 | 第40页 |
| 2.1.11 Onc4的摇瓶发酵 | 第40-41页 |
| 2.1.12 Western Blot分析 | 第41-42页 |
| 2.1.13 Onc-V3的纯化小试 | 第42-43页 |
| 2.1.14 Onc-V3蛋白的Rnase活性测定 | 第43-44页 |
| 2.1.15 Onc-V3蛋白含量测定 | 第44-45页 |
| 2.2 结果 | 第45-53页 |
| 2.2.1 pGAPZαA-Onc-V3质粒 | 第45-46页 |
| 2.2.2 毕赤酵母电转化条件筛选 | 第46页 |
| 2.2.3 毕赤酵母高拷贝转化子筛选 | 第46-47页 |
| 2.2.4 Tricine电泳筛选高表达Onc-V3的毕赤酵母X-33工程菌 | 第47页 |
| 2.2.5 重组子Onc4遗传稳定性研究 | 第47-48页 |
| 2.2.6 pGAPZα A-Onc-V3转化X-33阳性克隆PCR结果 | 第48-49页 |
| 2.2.7 含Onc-V3毕赤酵母X-33工程菌摇瓶培养 | 第49-50页 |
| 2.2.8 Western Blot分析 | 第50页 |
| 2.2.9 Onc-V3的纯化小试 | 第50-51页 |
| 2.2.10 Onc-V3酶活性测定 | 第51-52页 |
| 2.2.11 Onc-V3蛋白含量测定 | 第52-53页 |
| 2.3 讨论 | 第53-54页 |
| 第3章 重组毕赤酵母ONC-V3的优化表达 | 第54-78页 |
| 3.1 材料与方法 | 第54-61页 |
| 3.1.1 仪器及设备 | 第54页 |
| 3.1.2 主要溶液配制 | 第54-55页 |
| 3.1.3 毕赤酵母表达Onc-V3的培养条件选择 | 第55-56页 |
| 3.1.4 响应面分析法对于发酵表达Onc-V3条件的优化 | 第56-58页 |
| 3.1.5 毕赤酵母发酵罐发酵表达Onc-V3 | 第58-60页 |
| 3.1.6 发酵液Onc-V3样品粗处理 | 第60页 |
| 3.1.7 Ni-Sepharose亲和层析 | 第60页 |
| 3.1.8 凝胶过滤层析 | 第60-61页 |
| 3.1.9 Onc-V3的测定 | 第61页 |
| 3.1.10 HPLC法检测Onc-V3纯度 | 第61页 |
| 3.2 结果 | 第61-75页 |
| 3.2.1 毕赤酵母表达Onc-V3最佳碳源的确定 | 第61-62页 |
| 3.2.2 毕赤酵母表达Onc-V3最佳氮源的确定 | 第62-63页 |
| 3.2.3 毕赤酵母表达ONC-V3最佳温度的确定 | 第63页 |
| 3.2.4 毕赤酵母表达ONC-V3最佳PH值的确定 | 第63-64页 |
| 3.2.5 ONC-V3摇瓶发酵条件响应面分析优化 | 第64-72页 |
| 3.2.6 ONC-V3发酵罐发酵结果 | 第72-73页 |
| 3.2.7 ONC-V3发酵罐发酵纯化结果 | 第73-74页 |
| 3.2.8 高效液相色谱法检测ONC-V3纯度 | 第74-75页 |
| 3.3 讨论 | 第75-78页 |
| 第4章 ONC-V3对肿瘤细胞抑制作用研究 | 第78-121页 |
| 4.1 材料与方法 | 第78-89页 |
| 4.1.1 器材及设备材料 | 第78-79页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第79页 |
| 4.1.3 细胞株 | 第79页 |
| 4.1.4 试剂配制 | 第79-80页 |
| 4.1.5 Onc-V3的溶血实验 | 第80页 |
| 4.1.6 细胞培养 | 第80-81页 |
| 4.1.7 Onc-V3对肿瘤细胞的生长抑制作用 | 第81-82页 |
| 4.1.8 DNA ladder实验 | 第82-83页 |
| 4.1.9 观察蛋白Onc-V3在细胞中的分布 | 第83-84页 |
| 4.1.10 DAPI染色观察细胞形态 | 第84页 |
| 4.1.11 流式细胞术分析Onc-V3的作用机制 | 第84-85页 |
| 4.1.12 Onc-V3对于肿瘤细胞迁移的影响 | 第85页 |
| 4.1.13 Onc-V3对于肿瘤细胞侵袭的影响 | 第85-86页 |
| 4.1.14 Onc-V3诱导肿瘤细胞HO-8910PM凋亡的细胞信号通路 | 第86-89页 |
| 4.2 实验结果 | 第89-118页 |
| 4.2.1 Onc-V3溶血实验 | 第89-91页 |
| 4.2.2 Onc-V3对细胞的抑制作用 | 第91-103页 |
| 4.2.2.1 Onc-V3 对 HEK293 细胞的作用 | 第91-93页 |
| 4.2.2.2 Onc-V3对A549细胞的作用 | 第93-95页 |
| 4.2.2.3 Onc-V3对HepG2细胞的作用 | 第95-97页 |
| 4.2.2.4 Onc-V3对MCF-7 细胞的作用 | 第97-99页 |
| 4.2.2.5 Onc-V3对Hela细胞的作用 | 第99-101页 |
| 4.2.2.6 Onc-V3对HO-8910PM细胞的作用 | 第101-103页 |
| 4.2.3 DNA ladder实验 | 第103-104页 |
| 4.2.4 Onc-V3在HO-8910PM细胞中的分布 | 第104-106页 |
| 4.2.5 DAPI染色观察细胞形态 | 第106-107页 |
| 4.2.6 流式细胞仪检测Onc-V3对HO-8910PM细胞的抑制作用 | 第107-110页 |
| 4.2.7 Onc-V3对HO-8910PM细胞迁移的影响 | 第110-114页 |
| 4.2.8 Onc-V3对HO-8910PM细胞侵袭的影响 | 第114-116页 |
| 4.2.9 Onc-V3诱导HO-8910PM细胞凋亡的信号通路分析 | 第116-118页 |
| 4.3 讨论 | 第118-121页 |
| 第5章 结论 | 第121-122页 |
| 参考文献 | 第122-144页 |
| 作者简介 | 第144-146页 |
| 致谢 | 第146页 |
