| ACKNOWLEDGEMENT | 第4-11页 |
| Chapter-Ⅰ | 第11-16页 |
| Summary | 第12-15页 |
| 1.1 Background and Experimental Setup | 第12页 |
| 1.2 Metallothionein of M.rosenbergii | 第12-13页 |
| 1.3 Mar-MT-I as Biomarker | 第13-14页 |
| 1.4 Hsp70 family as Biomarker | 第14-15页 |
| 1.5 Relationship between Mar-MT and Hsc70 | 第15-16页 |
| Chapter-Ⅱ | 第16-20页 |
| Introduction | 第17-20页 |
| Chapter-Ⅲ | 第20-88页 |
| Metallothionein | 第21-88页 |
| 3.1 Introduction | 第21-40页 |
| 3.1.1 Principal characteristics of MTs | 第21-22页 |
| 3.1.2 Isoforms of MT | 第22-23页 |
| 3.1.3 Expression and degradation | 第23-25页 |
| 3.1.4 Problems in MT Quantification | 第25-26页 |
| 3.1.5 MT Induction Dependent on Metal Type,Dose,Exposure Time & Conditions and Organism | 第26-33页 |
| 3.1.5.1 Metal Type | 第26-28页 |
| 3.1.5.2 Organism/biological characteristics | 第28-30页 |
| 3.1.5.3 Dose and Exposure Time | 第30-32页 |
| 3.1.5.4 Exposure Conditions | 第32-33页 |
| 3.1.6 Biological Roles of MTs | 第33-35页 |
| 3.1.7 MT as a biomarker of Metal Exposure | 第35-36页 |
| 3.1.8 Problems in Using Different Species for Biomarker Studies | 第36-38页 |
| 3.1.8.1 Annelids | 第36页 |
| 3.1.8.2 Crustaceans | 第36-37页 |
| 3.1.8.3 Molluscs | 第37页 |
| 3.1.8.4 Fishes | 第37-38页 |
| 3.1.9 Other Confounding factors | 第38-39页 |
| 3.1.10 Aims of Present Study | 第39-40页 |
| 3.2 Materials and methods | 第40-44页 |
| 3.2.1 Materials | 第40页 |
| 3.2.1.1 Materials for Sampling | 第40页 |
| 3.2.2 Materials for Isolation of Total RNA | 第40-41页 |
| 3.2.2.1 Chemicals and Reagents | 第40-41页 |
| 3.2.2.2 Equipments | 第41页 |
| 3.2.2.3 Animals | 第41页 |
| 3.2.3 Materials for Isolation of MT cDNA | 第41-43页 |
| 3.2.3.1 Chemicals | 第41-42页 |
| 3.2.3.2 Equipments | 第42-43页 |
| 3.2.4 Materials for Northern Analysis | 第43-44页 |
| 3.3 Methodology | 第44-52页 |
| 3.3.1 Culturing of Prawns,Exposure to Stress and Sampling | 第44-45页 |
| 3.3.2 Isolation of total RNA | 第45-46页 |
| 3.3.3 Quantification of total RNA | 第46页 |
| 3.3.4 Primer Designing and Preparation | 第46-48页 |
| 3.3.5 Isolation and Cloning of MT Fragment | 第48页 |
| 3.3.6 RT-PCR for Preparation of First Strand cDNA | 第48-49页 |
| 3.3.7 Amplification of MT Fragment from cDNA Strand | 第49页 |
| 3.3.7.1 PCR Components | 第49页 |
| 3.3.7.2 PCR Conditions | 第49页 |
| 3.3.8 Ligation of MT Fragment | 第49-50页 |
| 3.3.9 Transformation | 第50页 |
| 3.3.10 Insert Check and Cloning of Transformed E.coli | 第50-52页 |
| 3.3.10.1 PCR Components | 第51页 |
| 3.3.10.2 PCR Conditions | 第51-52页 |
| 3.3.11 Isolation of Recombinant Plasmid and Sequencing | 第52页 |
| 3.4 Preparation of 5' RACE Product | 第52-55页 |
| 3.4.1 First Round of 5'RACE PCR | 第52-53页 |
| 3.4.1.1 PCR Components | 第52页 |
| 3.4.1.2 PCR Conditions | 第52-53页 |
| 3.4.2 Second Round of 5'RACE PCR | 第53-54页 |
| 3.4.2.1 PCR Components | 第53页 |
| 3.4.2.2 PCR Conditions | 第53-54页 |
| 3.4.3 5' RACE One Primer Check | 第54页 |
| 3.4.3.1 PCR Components | 第54页 |
| 3.4.3.2 PCR Conditions | 第54页 |
| 3.4.4 5' RACE Insert Check and Cloning of Transformed E.coli | 第54-55页 |
| 3.5 Preparation of 3' RACE Product | 第55-57页 |
| 3.5.1 First Round of 3' RACE PCR | 第55-56页 |
| 3.5.1.1 PCR Components | 第55页 |
| 3.5.1.2 PCR Conditions | 第55-56页 |
| 3.5.2 Second Round of 3' RACE PCR | 第56-57页 |
| 3.5.2.1 PCR Components | 第56页 |
| 3.5.2.2 PCR Conditions | 第56-57页 |
| 3.5.3 3' RACE One Primer Check | 第57页 |
| 3.5.3.1 PCR Components | 第57页 |
| 3.5.3.2 PCR Conditions | 第57页 |
| 3.5.4 3' RACE Insert Check and Cloning of Transformed E.coli | 第57页 |
| 3.6 Preparation of MT Probe for Northern Analysis | 第57-59页 |
| 3.6.1 Purification of Amplified cDNA | 第58页 |
| 3.6.2 Quantification of Purified PCR Product | 第58-59页 |
| 3.6.3 Labeling of Purified PCR Product | 第59页 |
| 3.7 Preparation of Solutions for Northern Analysis | 第59-61页 |
| 3.7.1 EDTA,0.5M(pH 8.0) | 第59页 |
| 3.7.2 TAE buffer,50X | 第59页 |
| 3.7.3 SSC,20X | 第59页 |
| 3.7.4 SDS,10%(100ml) | 第59-60页 |
| 3.7.5 Malic acid,10X | 第60页 |
| 3.7.6 1M Tris-HCl(pH 7.5) | 第60页 |
| 3.7.7 Washing-Ⅰ | 第60页 |
| 3.7.8 Washing-Ⅱ for RNA | 第60页 |
| 3.7.9 Washing Buffor | 第60页 |
| 3.7.10 Stripping Buffor | 第60-61页 |
| 3.7.11 Blocking Buffor | 第61页 |
| 3.7.12 Antobody Blocking Buffor | 第61页 |
| 3.7.13 DEPC Water | 第61页 |
| 3.8 Preformance of Northern Analysis | 第61-66页 |
| 3.8.1 Calculation of RNA value for loading the gel | 第61-62页 |
| 3.8.2 Loading of agarose gel with samples | 第62页 |
| 3.8.3 Washings of loaded gel | 第62-63页 |
| 3.8.4 Transferring of RNA onto membrane and probe hybridization | 第63页 |
| 3.8.5 Washing of membrane and signal detection | 第63-64页 |
| 3.8.8 Stripping of RNA membrane for reprobing | 第64-66页 |
| 3.9 Results | 第66-75页 |
| 3.9.1 Isolation and Characterization of MT cDNA | 第66-69页 |
| 3.9.2 Mar-MT-I Gene Expression Profile in Different Tissues | 第69-70页 |
| 3.9.3 Analysis of MT Gene Expression as Biomarker Response | 第70-75页 |
| 3.9.3.1 Heavy Metals Effect on MT Gene Expression in Hepatopancreas | 第70-74页 |
| 3.9.3.1.1 Cadmium Effect | 第70-71页 |
| 3.9.3.1.2 Copper Effect | 第71-72页 |
| 3.9.3.1.3 Zinc Effect | 第72-73页 |
| 3.9.3.1.4 Combined Heavy Metal and Heat Shock Effect | 第73-74页 |
| 3.9.3.2 Heavy Metals Effect on MT Gene Expression in Gills | 第74-75页 |
| 3.10 Discussion | 第75-88页 |
| 3.10.1 Isolation and Characterization of MT cDNA | 第75-80页 |
| 3.10.2 Mar-MT-I Gene Expression Profile in Different Tissues | 第80页 |
| 3.10.3 Biomarker Response of Mar-MT-I Gene | 第80-88页 |
| 3.10.3.1 Hepatopancreas | 第80-85页 |
| 3.10.3.2 Gills | 第85-88页 |
| Chapter-Ⅳ | 第88-110页 |
| Heat Shock Proteins- Hsp70 inducible | 第89-110页 |
| 4.1 Introduction | 第89-107页 |
| 4.1.1 Hsp70- Major stress inducible protein family | 第90-91页 |
| 4.1.2 Expression of Hsp70 in Different Conditions | 第91-92页 |
| 4.1.3 Favoring Evidences:Hsps as a Biomarker | 第92-96页 |
| 4.1.3.1 Aquatic Environment | 第92-94页 |
| 4.1.3.2 Terrestrial Environment | 第94-95页 |
| 4.1.3.3 Transgenic System | 第95-96页 |
| 4.1.4 Contradictory Evidences:Hsps as a Biomarker | 第96-98页 |
| 4.1.5 Critical Analysis | 第98-105页 |
| 4.1.6 Application of Biomarkers Set: | 第105-107页 |
| 4.2 Materials and Methods | 第107-108页 |
| 4.2.1 Materials | 第107页 |
| 4.2.2 Method | 第107-108页 |
| 4.3 Results | 第108页 |
| 4.4 Discussion | 第108-110页 |
| Chapter-Ⅴ | 第110-125页 |
| Heat Shock Proteins-Hsc70(Cognate) | 第111-125页 |
| 5.1 Introduction | 第111-112页 |
| 5.2 Materials and Methods | 第112-113页 |
| 5.2.1 Materials | 第112页 |
| 5.2.2 Methods | 第112-113页 |
| 5.3 Results | 第113-121页 |
| 5.3.1 Effect of Heavy Metals on Hsc70 expression in Hepatopancreas | 第113-117页 |
| 5.3.1.1 Cadmium Effect | 第113-114页 |
| 5.3.1.2 Copper Effect | 第114-115页 |
| 5.3.1.3 Zinc Effect | 第115-116页 |
| 5.3.1.4 Combined Heavy Metals and Thermal Effects | 第116-117页 |
| 5.3.2 Effect of Heavy Metals on Hsc70 expression in Gills | 第117-121页 |
| 5.3.2.1 Cadmium Effect | 第117页 |
| 5.3.2.2 Copper Effect | 第117-118页 |
| 5.3.2.3 Zinc Effect | 第118-120页 |
| 5.3.2.4 Combined Heavy Metals and Thermal Effect | 第120-121页 |
| 5.4 Discussion | 第121-125页 |
| Conclusions | 第125-129页 |
| References | 第129-154页 |
