摘要 | 第5-6页 |
Abstract | 第6页 |
第1章 研究背景 | 第11-37页 |
1.1 谷氧还蛋白和相关的巯基-二硫键氧化还原酶 | 第12-21页 |
1.1.1 谷氧还蛋白的结构和功能特点 | 第12-13页 |
1.1.2 CXXC催化位点 | 第13-16页 |
1.1.2.1 CXXC催化位点 | 第13页 |
1.1.2.2 氨基端半胱氨酸巯基的pKa值 | 第13-16页 |
1.1.3 蛋白质谷胱甘肽化/去谷胱甘肽化反应 | 第16-19页 |
1.1.3.1 蛋白质的谷胱甘肽化反应 | 第16-19页 |
1.1.3.2 蛋白质的去谷胱甘肽化反应 | 第19页 |
1.1.4 谷氧还蛋白的氧化还原偶联 | 第19-20页 |
1.1.5 谷氧还蛋白与铁硫簇 | 第20-21页 |
1.2 谷氧还蛋白的催化机制 | 第21-24页 |
1.2.1 巯基-二硫键氧化还原酶催化机制 | 第21页 |
1.2.2 依赖于谷胱甘肽的谷氧还蛋白催化机制 | 第21-22页 |
1.2.3 谷氧还蛋白的底物 | 第22-24页 |
1.3 谷氧还蛋白的结构 | 第24-26页 |
1.3.1 谷氧还蛋白的底物识别 | 第25页 |
1.3.2 谷氧还蛋白催化反应中的结构改变 | 第25-26页 |
1.3.3 谷胱甘肽化反应中的疏水相互作用和静电相互作用 | 第26页 |
1.4 不同物种中的谷氧还蛋白 | 第26-30页 |
1.4.1 哺乳动物谷氧还蛋白 | 第26-27页 |
1.4.2 酵母谷氧还蛋白 | 第27-29页 |
1.4.3 植物谷氧还蛋白 | 第29-30页 |
1.5 谷氧还蛋白的活性测定 | 第30-31页 |
1.5.1 RNR测定方法和PAPS法 | 第30页 |
1.5.2 HEDS测定方法 | 第30-31页 |
1.6 酵母谷氧还蛋白Grx8的生化研究 | 第31页 |
1.7 谷氧还蛋白的催化模式 | 第31-37页 |
1.7.1 谷胱甘肽支架模型 | 第31-32页 |
1.7.2 谷胱甘肽激活模型 | 第32-33页 |
1.7.3 半胱氨酸辅助模型 | 第33-34页 |
1.7.4 谷氧还蛋白催化机制分析 | 第34-37页 |
第2章 材料与方法 | 第37-65页 |
2.1 试剂,质粒及其来源 | 第37页 |
2.2 重组质粒的构建 | 第37-44页 |
2.2.1 基因来源 | 第37页 |
2.2.2 载体选择 | 第37页 |
2.2.3 引物合成 | 第37-38页 |
2.2.4 点突变实验 | 第38-42页 |
2.2.5 PCR反应 | 第42-43页 |
2.2.6 胶回收 | 第43页 |
2.2.7 PCR纯化产物的酶切 | 第43页 |
2.2.8 载体连接 | 第43-44页 |
2.2.9 转化感受态细胞和克隆筛选 | 第44页 |
2.3 重组蛋白的表达 | 第44-47页 |
2.3.1 IPTG诱导重组蛋白质的表达 | 第45页 |
2.3.2 无机培养基配方 | 第45-47页 |
2.4 重组蛋白的纯化 | 第47-48页 |
2.4.1 Ni-NTA柱纯化 | 第47页 |
2.4.2 分子筛纯化 | 第47-48页 |
2.4.3 蛋白质样品的浓缩 | 第48页 |
2.5 多维核磁共振实验 | 第48-53页 |
2.5.1 主要记谱参数 | 第48页 |
2.5.2 核磁数据处理 | 第48-53页 |
2.5.2.1 主链认证 | 第49-50页 |
2.5.2.2 侧链认证 | 第50页 |
2.5.2.3 NOSEY认证 | 第50-51页 |
2.5.2.4 结构计算 | 第51-53页 |
2.5.2.5 核磁滴定 | 第53页 |
2.5.2.6 测定解离常数 | 第53页 |
2.6 酶活实验 | 第53-65页 |
2.6.1 HEDS酶活测定 | 第53-54页 |
2.6.2 HEDS酶活中表观动力学常数的测定 | 第54-56页 |
2.6.3 蛋白质浓度的测定 | 第56页 |
2.6.4 测定氨基端半胱氨酸的pKa值 | 第56-59页 |
2.6.5 双底物动力学 | 第59-61页 |
2.6.6 谷胱甘肽-S-转移酶活性 | 第61-62页 |
2.6.7 圆二色光谱分析 | 第62-65页 |
第3章 结果 | 第65-81页 |
3.1 Grx8的一级序列分析 | 第65-66页 |
3.2 Grx8的溶液结构 | 第66-70页 |
3.2.1 Grx8溶液结构的解析 | 第66-68页 |
3.2.2 Grx8的结构描述 | 第68页 |
3.2.3 Grx8和二巯基谷氧还蛋白Grx1/Grx2的结构比对 | 第68-70页 |
3.3 Grx8催化活性研究 | 第70-78页 |
3.3.1 Grx8在HEDS测定中表现出很低的催化活性 | 第70页 |
3.3.2 突变体D35Y依赖谷胱甘肽的氧化还原酶活性显著提高 | 第70-72页 |
3.3.3 通过核磁滴定确定可能的谷胱甘肽识别位点 | 第72-74页 |
3.3.4 谷胱甘肽-S-转移酶活性 | 第74-75页 |
3.3.5 Grx8突变体的HEDS活性明显上升 | 第75页 |
3.3.6 Grx8和突变体的双底物动力学研究 | 第75-78页 |
3.4 Grx8与GSH相互作用研究 | 第78-81页 |
3.4.1 核磁滴定实验 | 第78页 |
3.4.2 S-甲基谷胱甘肽抑制试验 | 第78-81页 |
第4章 讨论 | 第81-85页 |
4.1 Grx8 Asp35/Ans80/Leu81是影响催化活性的关键氨基酸 | 第81-82页 |
4.2 Grx8和突变体的催化机制 | 第82-83页 |
4.3 研究展望 | 第83-85页 |
参考文献 | 第85-97页 |
致谢 | 第97-99页 |
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 | 第99页 |