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酵母氧化应激蛋白质Grx8的核磁结构和酶催化机制研究

摘要第5-6页
Abstract第6页
第1章 研究背景第11-37页
    1.1 谷氧还蛋白和相关的巯基-二硫键氧化还原酶第12-21页
        1.1.1 谷氧还蛋白的结构和功能特点第12-13页
        1.1.2 CXXC催化位点第13-16页
            1.1.2.1 CXXC催化位点第13页
            1.1.2.2 氨基端半胱氨酸巯基的pKa值第13-16页
        1.1.3 蛋白质谷胱甘肽化/去谷胱甘肽化反应第16-19页
            1.1.3.1 蛋白质的谷胱甘肽化反应第16-19页
            1.1.3.2 蛋白质的去谷胱甘肽化反应第19页
        1.1.4 谷氧还蛋白的氧化还原偶联第19-20页
        1.1.5 谷氧还蛋白与铁硫簇第20-21页
    1.2 谷氧还蛋白的催化机制第21-24页
        1.2.1 巯基-二硫键氧化还原酶催化机制第21页
        1.2.2 依赖于谷胱甘肽的谷氧还蛋白催化机制第21-22页
        1.2.3 谷氧还蛋白的底物第22-24页
    1.3 谷氧还蛋白的结构第24-26页
        1.3.1 谷氧还蛋白的底物识别第25页
        1.3.2 谷氧还蛋白催化反应中的结构改变第25-26页
        1.3.3 谷胱甘肽化反应中的疏水相互作用和静电相互作用第26页
    1.4 不同物种中的谷氧还蛋白第26-30页
        1.4.1 哺乳动物谷氧还蛋白第26-27页
        1.4.2 酵母谷氧还蛋白第27-29页
        1.4.3 植物谷氧还蛋白第29-30页
    1.5 谷氧还蛋白的活性测定第30-31页
        1.5.1 RNR测定方法和PAPS法第30页
        1.5.2 HEDS测定方法第30-31页
    1.6 酵母谷氧还蛋白Grx8的生化研究第31页
    1.7 谷氧还蛋白的催化模式第31-37页
        1.7.1 谷胱甘肽支架模型第31-32页
        1.7.2 谷胱甘肽激活模型第32-33页
        1.7.3 半胱氨酸辅助模型第33-34页
        1.7.4 谷氧还蛋白催化机制分析第34-37页
第2章 材料与方法第37-65页
    2.1 试剂,质粒及其来源第37页
    2.2 重组质粒的构建第37-44页
        2.2.1 基因来源第37页
        2.2.2 载体选择第37页
        2.2.3 引物合成第37-38页
        2.2.4 点突变实验第38-42页
        2.2.5 PCR反应第42-43页
        2.2.6 胶回收第43页
        2.2.7 PCR纯化产物的酶切第43页
        2.2.8 载体连接第43-44页
        2.2.9 转化感受态细胞和克隆筛选第44页
    2.3 重组蛋白的表达第44-47页
        2.3.1 IPTG诱导重组蛋白质的表达第45页
        2.3.2 无机培养基配方第45-47页
    2.4 重组蛋白的纯化第47-48页
        2.4.1 Ni-NTA柱纯化第47页
        2.4.2 分子筛纯化第47-48页
        2.4.3 蛋白质样品的浓缩第48页
    2.5 多维核磁共振实验第48-53页
        2.5.1 主要记谱参数第48页
        2.5.2 核磁数据处理第48-53页
            2.5.2.1 主链认证第49-50页
            2.5.2.2 侧链认证第50页
            2.5.2.3 NOSEY认证第50-51页
            2.5.2.4 结构计算第51-53页
            2.5.2.5 核磁滴定第53页
            2.5.2.6 测定解离常数第53页
    2.6 酶活实验第53-65页
        2.6.1 HEDS酶活测定第53-54页
        2.6.2 HEDS酶活中表观动力学常数的测定第54-56页
        2.6.3 蛋白质浓度的测定第56页
        2.6.4 测定氨基端半胱氨酸的pKa值第56-59页
        2.6.5 双底物动力学第59-61页
        2.6.6 谷胱甘肽-S-转移酶活性第61-62页
        2.6.7 圆二色光谱分析第62-65页
第3章 结果第65-81页
    3.1 Grx8的一级序列分析第65-66页
    3.2 Grx8的溶液结构第66-70页
        3.2.1 Grx8溶液结构的解析第66-68页
        3.2.2 Grx8的结构描述第68页
        3.2.3 Grx8和二巯基谷氧还蛋白Grx1/Grx2的结构比对第68-70页
    3.3 Grx8催化活性研究第70-78页
        3.3.1 Grx8在HEDS测定中表现出很低的催化活性第70页
        3.3.2 突变体D35Y依赖谷胱甘肽的氧化还原酶活性显著提高第70-72页
        3.3.3 通过核磁滴定确定可能的谷胱甘肽识别位点第72-74页
        3.3.4 谷胱甘肽-S-转移酶活性第74-75页
        3.3.5 Grx8突变体的HEDS活性明显上升第75页
        3.3.6 Grx8和突变体的双底物动力学研究第75-78页
    3.4 Grx8与GSH相互作用研究第78-81页
        3.4.1 核磁滴定实验第78页
        3.4.2 S-甲基谷胱甘肽抑制试验第78-81页
第4章 讨论第81-85页
    4.1 Grx8 Asp35/Ans80/Leu81是影响催化活性的关键氨基酸第81-82页
    4.2 Grx8和突变体的催化机制第82-83页
    4.3 研究展望第83-85页
参考文献第85-97页
致谢第97-99页
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果第99页

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