| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 研究进展 | 第15-30页 |
| 1 己烯雌酚的理化性质 | 第15页 |
| 2 己烯雌酚的药理作用 | 第15-16页 |
| 3 己烯雌酚的临床应用 | 第16-17页 |
| 3.1 DES在医学临床上的应用 | 第16-17页 |
| 3.2 DES在兽医临床上的应用 | 第17页 |
| 4 己烯雌酚的危害 | 第17-19页 |
| 4.1 DES对生殖系统的危害 | 第18-19页 |
| 4.1.1 DES对雄性生殖系统的危害 | 第18页 |
| 4.1.2 DES对雌性生殖系统的危害 | 第18-19页 |
| 4.2 DES对环境的危害 | 第19页 |
| 5 己烯雌酚在畜牧养殖业的应用规定 | 第19-20页 |
| 6 己烯雌酚的检测方法 | 第20-27页 |
| 6.1 理化检测法 | 第20-23页 |
| 6.1.1 气相色谱法(gas phase chromatography,GC) | 第20-21页 |
| 6.1.2 液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC) | 第21页 |
| 6.1.3 薄层色谱法(Thin-Layer Chromatography,TLC) | 第21-22页 |
| 6.1.4 联用技术 | 第22-23页 |
| 6.1.5 毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis,CE) | 第23页 |
| 6.1.6 化学发光(CL)分析法 | 第23页 |
| 6.2 免疫检测法 | 第23-27页 |
| 6.2.1 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) | 第24-25页 |
| 6.2.2 胶体金免疫层析技术 | 第25-27页 |
| 7 本研究的背景、目的及意义 | 第27-28页 |
| 8 本研究的主要内容和技术路线 | 第28-30页 |
| 8.1 研究的主要内容 | 第28-29页 |
| 8.2 技术路线 | 第29-30页 |
| 第二章 己烯雌酚人工抗原的合成及抗血清的制备 | 第30-44页 |
| 1 材料 | 第30-32页 |
| 1.1 试剂和溶液 | 第30-32页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第32页 |
| 1.3 试验动物 | 第32页 |
| 2 方法 | 第32-37页 |
| 2.1 DES人工抗原的合成 | 第32-34页 |
| 2.1.1 己烯雌酚-单羧基丙基醚(DES-MCPE)的合成 | 第32-33页 |
| 2.1.2 DES-BSA免疫原、DES-OVA包被原的制备 | 第33-34页 |
| 2.2 DES人工抗原的鉴定 | 第34页 |
| 2.2.1 UV鉴定DES人工抗原 | 第34页 |
| 2.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定DES人工抗原 | 第34页 |
| 2.3 DES抗血清(pAb)的制备 | 第34-35页 |
| 2.4 DES pAb的鉴定 | 第35-37页 |
| 2.4.1 DES pAb效价测定 | 第35-36页 |
| 2.4.2 DES pAb敏感性鉴定 | 第36页 |
| 2.4.3 DES pAb特异性测定 | 第36-37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-40页 |
| 3.1 DES人工抗原的鉴定 | 第37-38页 |
| 3.1.1 UV鉴定结果 | 第37-38页 |
| 3.1.2 SDS-PAGE鉴定结果 | 第38页 |
| 3.2 DES pAb的鉴定结果 | 第38-40页 |
| 3.2.1 DES pAb间接ELISA检测结果 | 第38页 |
| 3.2.2 DES pAb敏感性鉴定结果 | 第38-40页 |
| 3.2.3 DES pAb特异性鉴定结果 | 第40页 |
| 4 讨论 | 第40-43页 |
| 4.1 DES-MCPE的合成 | 第40-41页 |
| 4.2 选择适宜的载体蛋白 | 第41-42页 |
| 4.3 半抗原的偶联比 | 第42页 |
| 4.4 免疫动物和免疫途径的选取 | 第42-43页 |
| 4.5 DES完全抗原的鉴定 | 第43页 |
| 5 小结 | 第43-44页 |
| 第三章 己烯雌酚单克隆抗体的制备及其免疫学特性的鉴定 | 第44-60页 |
| 1 材料 | 第44-46页 |
| 1.1 试剂与溶液 | 第44-45页 |
| 1.1.1 主要试剂 | 第44-45页 |
| 1.1.2 主要实验试剂的配制 | 第45页 |
| 1.2 主要仪器 | 第45-46页 |
| 1.3 试验动物 | 第46页 |
| 2 方法 | 第46-51页 |
| 2.1 杂交瘤细胞株的建立 | 第46-49页 |
| 2.1.1 选择细胞融合备用鼠 | 第46页 |
| 2.1.2 SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0 Myeloma cells)的准备 | 第46-47页 |
| 2.1.3 饲养细胞的制备 | 第47页 |
| 2.1.4 脾细胞的制备 | 第47页 |
| 2.1.5 细胞融合 | 第47-48页 |
| 2.1.6 杂交瘤细胞(Hybridoma cells)的筛选 | 第48页 |
| 2.1.7 克隆阳性杂交瘤细胞 | 第48-49页 |
| 2.1.8 Hybridoma cells的扩大培养 | 第49页 |
| 2.1.9 Hybridoma cells的冻存 | 第49页 |
| 2.2 DES McAb的制备 | 第49-50页 |
| 2.3 DES单克隆抗体(McAb)的鉴定 | 第50-51页 |
| 2.3.1 DES McAb效价的测定 | 第50页 |
| 2.3.2 DE SMcAb敏感性鉴定 | 第50页 |
| 2.3.3 DES McAb亲和力鉴定 | 第50-51页 |
| 2.3.4 间接ELISA鉴定DES McAb的亚型 | 第51页 |
| 2.3.5 DES McAb特异性鉴定 | 第51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-54页 |
| 3.1 融合细胞的显微镜检查 | 第51-52页 |
| 3.2 杂交瘤细胞株的筛选 | 第52页 |
| 3.3 效价测定结果 | 第52-53页 |
| 3.4 敏感性鉴定结果 | 第53页 |
| 3.5 亲和力鉴定结果 | 第53-54页 |
| 3.6 亚型分析结果 | 第54页 |
| 3.7 特异性鉴定结果 | 第54页 |
| 4 讨论 | 第54-59页 |
| 4.1 影响细胞融合的因素 | 第54-56页 |
| 4.1.1 Myeloma cells系的选择 | 第55页 |
| 4.1.2 脾细胞的敏感性 | 第55页 |
| 4.1.3 饲养细胞的量 | 第55页 |
| 4.1.4 融合剂聚乙二醇的使用 | 第55-56页 |
| 4.2 杂交瘤细胞株的建立 | 第56页 |
| 4.3 DES pAb和DES McAb的对比 | 第56-57页 |
| 4.4 关于DES McAb的大量生产 | 第57-58页 |
| 4.4.1 体外细胞培养法 | 第58页 |
| 4.4.2 动物体内诱生法 | 第58页 |
| 4.5 DES McAb的鉴定 | 第58-59页 |
| 5 小结 | 第59-60页 |
| 第四章 己烯雌酚间接竞争ELISA试剂盒的研制 | 第60-77页 |
| 1 材料 | 第60-61页 |
| 1.1 试剂与溶液 | 第60页 |
| 1.2 仪器 | 第60页 |
| 1.3 杂交瘤细胞、DES McAb | 第60-61页 |
| 2 方法 | 第61-65页 |
| 2.1 DES检测ci-ELISA实验条件的优化 | 第61-62页 |
| 2.1.1 DES-OVA的包被浓度、DESMcAb的工作浓度的选取(方阵滴定实验) | 第61页 |
| 2.1.2 GaMIgG-HRP稀释浓度的选取 | 第61页 |
| 2.1.3 DES-OVA包被时间的选取 | 第61页 |
| 2.1.4 封闭液、封闭时间的选取 | 第61-62页 |
| 2.1.5 TMB显色液显色时间的选取 | 第62页 |
| 2.1.6 ci-ELISA方法的建立 | 第62页 |
| 2.1.7 绘制标准曲线 | 第62页 |
| 2.2 DES-Kit的配置、操作步骤和结果判定 | 第62-64页 |
| 2.2.1 DES-Kit的配置 | 第62-63页 |
| 2.2.2 测定样品的前处理 | 第63页 |
| 2.2.3 DES-kit的操作步骤 | 第63-64页 |
| 2.2.4 结果判定 | 第64页 |
| 2.3 DES-Kit的性能测定 | 第64-65页 |
| 2.3.1 准确度 | 第64页 |
| 2.3.2 精密度 | 第64页 |
| 2.3.3 特异性 | 第64-65页 |
| 2.3.4 灵敏度(检测限) | 第65页 |
| 2.3.5 稳定性 | 第65页 |
| 3 结果与分析 | 第65-71页 |
| 3.1 DES检测ci-ELISA反应条件的优化 | 第65-68页 |
| 3.1.1 DES-OVA包被浓度和DEESMcAb工作浓度的选取 | 第65-66页 |
| 3.1.2 GaMIgG-HRP稀释浓度的选取 | 第66页 |
| 3.1.3 DES-OVA包被时间的选取 | 第66-67页 |
| 3.1.4 封闭液、封闭时间的选取 | 第67页 |
| 3.1.5 TMB显色液显色时间的选取 | 第67-68页 |
| 3.1.6 标准曲线的绘制与曲线拟合 | 第68页 |
| 3.2 DES检测ci-ELISA反应体系的建立 | 第68-69页 |
| 3.3 DES-Kit的性能测定 | 第69-71页 |
| 3.3.1 准确度检测结果 | 第69-70页 |
| 3.3.2 精密度检测结果 | 第70页 |
| 3.3.3 特异性检测结果 | 第70页 |
| 3.3.4 灵敏度检测结果 | 第70-71页 |
| 3.3.5 稳定性检测结果 | 第71页 |
| 4 讨论 | 第71-76页 |
| 4.1 小分子半抗原的ELISA检测技术的反应模式 | 第71-73页 |
| 4.2 ELISA的各个关键技术环节 | 第73-74页 |
| 4.2.1 包被结果 | 第73-74页 |
| 4.2.2 封闭效果 | 第74页 |
| 4.2.3 GaMIgG-HRP的稀释浓度 | 第74页 |
| 4.3 DES-Kit的质量特性 | 第74-75页 |
| 4.4 测定样品的添加回收率 | 第75页 |
| 4.5 样品的提取及纯化 | 第75-76页 |
| 5 小结 | 第76-77页 |
| 第五章 己烯雌酚残留快速检测免疫金标试纸的制备、性能测定 | 第77-95页 |
| 1 材料 | 第77-78页 |
| 1.1 试剂 | 第77-78页 |
| 1.2 主要仪器 | 第78页 |
| 2 方法 | 第78-83页 |
| 2.1 DES McAb的制备与纯化 | 第78-79页 |
| 2.2 胶体金的制备、质量鉴定 | 第79页 |
| 2.2.1 胶体金的制备 | 第79页 |
| 2.2.2 胶体金的质量鉴定 | 第79页 |
| 2.3 胶体金标记抗体 | 第79-80页 |
| 2.3.1 胶体金溶液和将要标记的DES McAb的前处理 | 第79-80页 |
| 2.3.2 DES McAb最优胶体金标记浓度的选取 | 第80页 |
| 2.3.3 胶体金标记DES McAb | 第80页 |
| 2.4 检测试纸的制备 | 第80-81页 |
| 2.4.1 金标抗体(Au-McAb)玻璃纤维棉的处理 | 第80页 |
| 2.4.2 NC膜印迹的制备 | 第80-81页 |
| 2.4.3 检测试纸的组装 | 第81页 |
| 2.5 试纸检测方法的建立 | 第81-82页 |
| 2.5.1 目测半定量测定法的建立 | 第81-82页 |
| 2.5.2 机读定量测定法的建立 | 第82页 |
| 2.6 测定样品的前处理 | 第82-83页 |
| 2.7 DES-strip的性能测定 | 第83页 |
| 2.7.1 重复性检测 | 第83页 |
| 2.7.2 敏感性检测 | 第83页 |
| 2.7.3 有效期检测 | 第83页 |
| 2.7.4 特异性检测 | 第83页 |
| 3 结果与分析 | 第83-89页 |
| 3.1 胶体金的质量鉴定 | 第83-85页 |
| 3.1.1 紫外可见扫描 | 第83-84页 |
| 3.1.2 投射电镜扫描 | 第84-85页 |
| 3.2 DES McAb最优胶体金标记浓度的选取 | 第85页 |
| 3.3 DES-Strip的组装 | 第85-86页 |
| 3.4 DES-Strip检测方法的建立 | 第86-88页 |
| 3.4.1 定量机读测定法的建立 | 第86-87页 |
| 3.4.2 半定量目测测定法、检出限 | 第87-88页 |
| 3.5 DES-strip的性能测定 | 第88-89页 |
| 3.5.1 重复性检测 | 第88页 |
| 3.5.2 敏感性检测 | 第88页 |
| 3.5.3 有效期检测 | 第88页 |
| 3.5.4 特异性检测 | 第88-89页 |
| 4 讨论 | 第89-94页 |
| 4.1 胶体金的制备 | 第89-91页 |
| 4.1.1 胶体金的还原技术 | 第89-90页 |
| 4.1.2 胶体金颗粒直径的选取 | 第90页 |
| 4.1.3 胶体金的质量评定 | 第90-91页 |
| 4.2 胶体金标记DES McAb | 第91-92页 |
| 4.2.1 胶体金标记DES McAb时的pH值的选取 | 第91-92页 |
| 4.2.2 胶体金标记DES McAb最优浓度的选取 | 第92页 |
| 4.3 硝酸纤维素膜的选取 | 第92页 |
| 4.4 DES-strip的检测原理 | 第92-94页 |
| 4.5 DES-strip的质量特性 | 第94页 |
| 5 小结 | 第94-95页 |
| 第六章 DES-KIT、DES-STRIP和GC-MS、HPLC确证方法的对比 | 第95-107页 |
| 1 材料 | 第95-96页 |
| 1.1 主要试剂 | 第95页 |
| 1.2 主要仪器 | 第95-96页 |
| 2 方法 | 第96-99页 |
| 2.1 实验动物的饲喂 | 第96页 |
| 2.2 DES-Kit、DES-Strip法标准品配制及测定 | 第96页 |
| 2.3 GC-MS法标准品配制及检测 | 第96-98页 |
| 2.3.1 标准品配制 | 第96页 |
| 2.3.2 固相萃取 | 第96-97页 |
| 2.3.3 衍生化处理 | 第97页 |
| 2.3.4 确定GC-MS检测条件 | 第97页 |
| 2.3.5 绘制标准曲线、得出回收率 | 第97-98页 |
| 2.4 HPLC法标准品的配制及检测 | 第98-99页 |
| 2.4.1 标准品配制 | 第98页 |
| 2.4.2 检测波长的选择 | 第98页 |
| 2.4.3 流动相的筛选 | 第98页 |
| 2.4.4 色谱条件的确定 | 第98页 |
| 2.4.5 绘制标准曲线、得出回收率 | 第98-99页 |
| 3 结果与分析 | 第99-103页 |
| 3.1 DES-Kit、DES-Strip和GC-MS、HPLC技术参数的对比 | 第99-100页 |
| 3.2 DES-Kit、DES-Strip与HPLC的对比 | 第100-101页 |
| 3.3 DES-Kit、DES-Strip与GC-MS的对比 | 第101-102页 |
| 3.4 DES-Kit、DES-Strip和GC-MS检测猪尿液中DES含量的结果对比 | 第102-103页 |
| 4 讨论 | 第103-105页 |
| 4.1 测定DES含量方法的标准 | 第103-104页 |
| 4.2 DES不同测定技术灵敏性的对比 | 第104页 |
| 4.3 DES残留不同检测技术所需时间和费用的对比 | 第104-105页 |
| 5 小结 | 第105-107页 |
| 研究结论 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
| 博士期间的研究成果 | 第122页 |
