| 第一章 本论文立论依据 | 第14-24页 |
| 第二章 含硒单链抗体模拟GPX | 第24-59页 |
| 第一节 序言 | 第24页 |
| 第二节 单链抗体的可溶性表达及其分离纯化 | 第24-44页 |
| 一、 实验材料 | 第25-26页 |
| 二、 实验方法 | 第26-31页 |
| 2.1 工程菌Rose-2F3的诱导表达条件的优化 | 第26-30页 |
| 2.1.1 采用正交设计进行表达条件的优化 | 第26-28页 |
| 2.1.2 采用化学伴侣进行表达条件的优化 | 第28-30页 |
| 2.2 单链抗体的分离纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.1 CM-Sepharose Fast Flow 离子交换层析 | 第30页 |
| 2.2.2 Chelating Sepharose Fast Flow 金属螯合亲和层析 | 第30-31页 |
| 2.3 表达产物的鉴定(Western Blotting) | 第31页 |
| 三、 结果 | 第31-43页 |
| 3.1 表达菌株诱导表达条件的优化 | 第31-40页 |
| 3.1.1 正交实验设计 | 第31-35页 |
| 3.1.2 化学伴侣对表达条件的影响 | 第35-40页 |
| 3.2 单链抗体的分离纯化 | 第40-41页 |
| 3.2.1 CM Sepharose Fast Flow离子交换柱的分离 | 第40-41页 |
| 3.2.2 金属螯合层析分离目的蛋白 | 第41页 |
| 3.3 单链抗体scFv 的蛋白印迹鉴定(Western Blotting) | 第41-43页 |
| 3.4 单链抗体的回收率 | 第43页 |
| 四、 讨论 | 第43-44页 |
| 第三节 含硒单链抗体的制备及酶学性质的研究 | 第44-59页 |
| 一、 实验材料 | 第44页 |
| 二、 实验方法 | 第44-47页 |
| 2.1 硒氢化钠(NaHSe)的制备 | 第44-45页 |
| 2.2 单链抗体的化学突变 | 第45页 |
| 2.3 GPX活力的测定 | 第45页 |
| 2.4 GSH结和常数测定 | 第45-46页 |
| 2.5 硒氢基含量的测定 | 第46页 |
| 2.6 最适pH和最适温度 | 第46页 |
| 2.7 稳态动力学性质研究 | 第46-47页 |
| 三、 结果 | 第47-53页 |
| 3.1 单链抗体的化学突变 | 第47页 |
| 3.2 含硒单链抗体的GPX活性 | 第47页 |
| 3.3 含硒单链抗体与GSH结合常数的测定 | 第47-49页 |
| 3.4 含硒单链抗体的最适pH和最适温度 | 第49-51页 |
| 3.5 含硒单链抗体的稳态动力学性质研究 | 第51-53页 |
| 四、 讨论 | 第53页 |
| 本章小结 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 第三章 含硒多肽模拟GPX | 第59-89页 |
| 第一节 序言 | 第59-61页 |
| 第二节 噬菌体肽库的筛选 | 第61-66页 |
| 一、 实验材料 | 第61-63页 |
| 二、 实验方法 | 第63-65页 |
| 2.1 肽库的扩增 | 第63页 |
| 2.2 滴度的测定 | 第63-64页 |
| 2.3 肽库的筛选 | 第64页 |
| 2.4 噬菌体纯化 | 第64-65页 |
| 2.5 DNA测序 | 第65页 |
| 三、 结果与讨论 | 第65-66页 |
| 第三节 制备含硒多肽模拟GPX | 第66-85页 |
| 一、 实验材料 | 第66-67页 |
| 二、 实验方法 | 第67-68页 |
| 2.1 NaHSe的制备 | 第67页 |
| 2.2 含硒多肽的制备 | 第67页 |
| 2.3 GSH结合常数测定 | 第67页 |
| 2.4 硒含量测定 | 第67-68页 |
| 2.5 蛋白质含量的测定 | 第68页 |
| 2.6 活力的测定 | 第68页 |
| 2.7 动力学研究 | 第68页 |
| 三、 结果 | 第68-83页 |
| 3.1 15SeP1的合成与表征 | 第68-70页 |
| 3.1.1 15SeP1的合成 | 第68-69页 |
| 3.1.2 15SeP1的表征 | 第69-70页 |
| 3.2 活力测定 | 第70页 |
| 3.3 多肽的设计 | 第70-75页 |
| 3.4 GSH结合常数的测定 | 第75-76页 |
| 3.5 圆二色谱分析 | 第76-79页 |
| 3.6 含硒多肽的最适温度和最适pH | 第79-80页 |
| 3.7 动力学分析 | 第80-83页 |
| 四、 讨论 | 第83-85页 |
| 本章小结 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-89页 |
| 第四章 GPX模拟物生物学效应的研究 | 第89-133页 |
| 第一节 序言 | 第89-91页 |
| 第二节 含硒单链抗体抗氧化作用的研究 | 第91-106页 |
| 一、 实验材料 | 第91-93页 |
| 二、 实验方法 | 第93-97页 |
| 2.1 表皮细胞的原代培养 | 第93页 |
| 2.2 脂质过氧化损伤模型的建立 | 第93页 |
| 2.3 MTT 法测细胞存活率 | 第93-94页 |
| 2.4 脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量测定 | 第94-95页 |
| 2.5 细胞胞浆酶-乳酸脱氢酶(LDH)含量测定 | 第95页 |
| 2.6 H2O2 含量测定 | 第95-96页 |
| 2.7 二苯胺(DPA)法测定DNA片段化 | 第96页 |
| 2.8 统计学处理 | 第96-97页 |
| 三、 结果 | 第97-106页 |
| 3.1 UVB 对原代培养表皮细胞的损伤作用 | 第97-98页 |
| 3.2 含硒单链抗体对UVB所致原代培养表皮细胞损伤的保护作用 | 第98-106页 |
| 3.2.1 不同浓度的含硒单链抗体对MDA含量的影响 | 第98-99页 |
| 3.2.2 含硒单链抗体对UVB照射后培养表皮细胞存活率的影响 | 第99-101页 |
| 3.2.3 含硒单链抗体对UVB照射后表皮细胞内LDH含量的影响 | 第101-103页 |
| 3.2.4 含硒单链抗体对UVB照射后表皮细胞DNA片段化的影响 | 第103-104页 |
| 3.2.5 含硒单链抗体对UVB照射后表皮细胞内H2O2含量的影响 | 第104-106页 |
| 四、 讨论 | 第106页 |
| 第三节 含硒多肽抗氧化作用的研究 | 第106-133页 |
| 一、 实验材料 | 第106-109页 |
| 二、 实验方法 | 第109-113页 |
| 2.1 表皮细胞的原代培养 | 第109页 |
| 2.2 脂质过氧化损伤模型的建立 | 第109页 |
| 2.3 SOD活力的测定 | 第109-110页 |
| 2.4 总GSH含量的测定 | 第110-111页 |
| 2.5 过氧化氢酶活力的测定 | 第111页 |
| 2.6 谷胱甘肽还原酶活力的测定 | 第111-112页 |
| 2.7 谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定 | 第112页 |
| 2.8 过氧化氢含量的测定 | 第112页 |
| 2.9 脂质过氧化产物丙二醛MDA的含量测定 | 第112-113页 |
| 2.10 MTT 法测细胞存活率 | 第113页 |
| 2.11 细胞胞浆酶-乳酸脱氢酶(LDH)含量测定 | 第113页 |
| 2.12 统计学处理 | 第113页 |
| 三、 结果与讨论 | 第113-126页 |
| 3.1 H2O2对培养表皮细胞的损伤作用 | 第113-117页 |
| 3.1.1 H2O2对培养表皮细胞膜通透性的影响 | 第113-114页 |
| 3.1.2 H2O2对培养表皮细胞存活率的影响 | 第114-115页 |
| 3.1.3 H2O2诱导培养表皮细胞脂质过氧化反应 | 第115-117页 |
| 3.2 GPX模拟物对H2O2损伤的培养表皮细胞的保护作用 | 第117-126页 |
| 3.2.1 15SeP对H2O2损伤的培养表皮细胞内MDA含量的影响 | 第117-118页 |
| 3.2.2 15SeP对H2O2损伤的培养表皮细胞内LDH含量的影响 | 第118-119页 |
| 3.2.3 15SeP对H2O2损伤的培养表皮细胞存活率的影响 | 第119-120页 |
| 3.2.4 15SeP对H2O2损伤的培养表皮细胞DNA片段化的影响 | 第120-121页 |
| 3.2.5 15SeP对H2O2损伤的培养表皮细胞GSH含量的影响 | 第121-123页 |
| 3.2.6 15SeP对H2O2损伤的培养表皮细胞抗氧化酶活力的影响 | 第123-126页 |
| 本章小结 | 第126-128页 |
| 参考文献 | 第128-133页 |
| 第五章 文献综述 | 第133-183页 |
| 第一节 自由基研究 | 第133-149页 |
| 第二节 含硒的谷胱甘肽过氧化物酶与人类健康的关系 | 第149-154页 |
| 第三节 谷胱甘肽过氧化物酶的人工模拟 | 第154-158页 |
| 第四节 噬菌体肽库技术的研究进展及应用研究 | 第158-183页 |
| 作者简历 | 第183-186页 |
| 致谢 | 第186-187页 |
| 中文摘要 | 第187-192页 |
| 英文摘要 | 第192页 |
