| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-29页 |
| 1.1 羰基类化合物的不对称还原 | 第11-13页 |
| 1.1.1 化学法不对称还原羰基 | 第11-12页 |
| 1.1.2 生物法不对称还原羰基 | 第12-13页 |
| 1.2 酮还原酶的研究现状 | 第13-22页 |
| 1.2.1 酮还原酶的分类 | 第13-17页 |
| 1.2.1.1 醛酮还原酶家族 | 第13-16页 |
| 1.2.1.2 短链脱氢酶/还原酶家族 | 第16页 |
| 1.2.1.3 中链脱氢酶/还原酶家族 | 第16-17页 |
| 1.2.2 酮还原酶的来源 | 第17-20页 |
| 1.2.2.1 产酶微生物的筛选和酶基因的克隆表达 | 第17-19页 |
| 1.2.2.2 Genome mining | 第19-20页 |
| 1.2.2.3 宏基因组研究 | 第20页 |
| 1.2.3 酮还原酶的应用 | 第20-22页 |
| 1.3 全细胞催化和酶催化 | 第22-23页 |
| 1.4 辅酶循环系统 | 第23-25页 |
| 1.4.1 底物偶联法 | 第23-24页 |
| 1.4.2 酶偶联法 | 第24-25页 |
| 1.5 酮还原酶催化反应的进一步优化 | 第25-27页 |
| 1.5.1 酶改造 | 第25-26页 |
| 1.5.2 酶固定化 | 第26页 |
| 1.5.3 介质工程 | 第26-27页 |
| 1.5.4 底物修饰 | 第27页 |
| 1.6 本课题的立题依据和研究内容 | 第27-29页 |
| 1.6.1 立题依据 | 第27-28页 |
| 1.6.2 研究内容 | 第28-29页 |
| 第二章 重组嗜热醛酮还原酶的表达 | 第29-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-30页 |
| 2.1.1 材料 | 第29-30页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-38页 |
| 2.2.1 重组表达质粒构建策略 | 第30页 |
| 2.2.2 PCR扩增目的基因 | 第30-32页 |
| 2.2.3 TA克隆 | 第32-34页 |
| 2.2.4 重组表达质粒的构建 | 第34-37页 |
| 2.2.5 醛酮还原酶的表达 | 第37页 |
| 2.2.6 表达产物SDS-PAGE分析 | 第37-38页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第38-41页 |
| 2.3.1 PCR扩增目的基因 | 第38页 |
| 2.3.3 TA克隆 | 第38-39页 |
| 2.3.4 重组表达载体pET28a-tadh1和pET28a-tadh2的鉴定 | 第39页 |
| 2.3.5 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第39-41页 |
| 2.4 小结 | 第41-43页 |
| 第三章 醛酮还原酶酶学性质的研究 | 第43-60页 |
| 3.1 实验材料 | 第43-44页 |
| 3.1.1 菌种 | 第43页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第43页 |
| 3.1.3 主要溶液与缓冲液 | 第43-44页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第44页 |
| 3.2 实验方法 | 第44-48页 |
| 3.2.1 重组目的蛋白的纯化 | 第44-45页 |
| 3.2.2 还原酶活力的测定 | 第45-46页 |
| 3.2.2.1 原理 | 第45页 |
| 3.2.2.2 标准曲线的绘制 | 第45-46页 |
| 3.2.2.3 酶活力测定方法 | 第46页 |
| 3.2.3 酶学性质研究 | 第46-48页 |
| 3.2.3.1 底物特异性 | 第46页 |
| 3.2.3.2 辅酶依赖性 | 第46-47页 |
| 3.2.3.3 pH对酶活力的影响 | 第47页 |
| 3.2.3.4 温度对酶活力的影响及热稳定性 | 第47页 |
| 3.2.3.5 金属离子对酶活的影响 | 第47-48页 |
| 3.2.3.6 抑制剂和表面活性剂对酶活的影响 | 第48页 |
| 3.2.3.7 有机溶剂对酶活的影响 | 第48页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第48-58页 |
| 3.3.1 重组目的蛋白的纯化 | 第48-49页 |
| 3.3.2 NADPH标准曲线的绘制 | 第49-50页 |
| 3.3.3 酶学性质的研究 | 第50-58页 |
| 3.3.3.1 底物特异性 | 第50-53页 |
| 3.3.3.2 辅酶依赖性 | 第53页 |
| 3.3.3.3 pH对酶活力的影响 | 第53页 |
| 3.3.3.4 温度对酶活力的影响及热稳定性 | 第53-57页 |
| 3.3.3.5 金属离子对酶活的影响 | 第57页 |
| 3.3.3.6 抑制剂和表面活性剂对酶活的影响 | 第57-58页 |
| 3.3.3.7 有机溶剂对酶活的影响 | 第58页 |
| 3.4 小结 | 第58-60页 |
| 第四章 醛酮还原酶不对称还原生成手性醇的研究 | 第60-74页 |
| 4.1 实验材料 | 第60-61页 |
| 4.1.1 菌种 | 第60页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第60-61页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第61页 |
| 4.2 实验方法 | 第61-65页 |
| 4.2.1 不对称还原反应 | 第61-64页 |
| 4.2.1.1 酶偶联再生辅酶反应系统 | 第61-62页 |
| 4.2.1.2 不对称还原2,2,2-三氟苯乙酮 | 第62-63页 |
| 4.2.1.3 不对称还原2-氧代-4苯基丁酸乙酯 | 第63页 |
| 4.2.1.4 不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯 | 第63-64页 |
| 4.2.2 还原过程中一些参量的计算 | 第64-65页 |
| 4.2.3 反应体系的优化 | 第65页 |
| 4.2.3.1 辅酶浓度 | 第65页 |
| 4.2.3.2 反应温度 | 第65页 |
| 4.2.3.3 反应体系pH | 第65页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第65-73页 |
| 4.3.1 酶偶联再生辅酶反应体系 | 第65-66页 |
| 4.3.2 不对称还原2,2,2-三氟苯乙酮 | 第66-67页 |
| 4.3.2.1 标准品液相图 | 第66页 |
| 4.3.2.2 还原反应产物液相色谱图 | 第66-67页 |
| 4.3.3 不对称还原2-氧代-4苯基丁酸乙酯 | 第67-68页 |
| 4.3.3.1 标准品液相图 | 第67页 |
| 4.3.3.2 还原反应产物液相色谱图 | 第67-68页 |
| 4.3.4 不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯 | 第68-69页 |
| 4.3.4.1 标准品液相图 | 第68-69页 |
| 4.3.4.2 还原反应产物液相色谱图 | 第69页 |
| 4.3.5 反应体系的优化 | 第69-73页 |
| 4.3.5.1 辅酶浓度 | 第69-71页 |
| 4.3.5.2 反应温度 | 第71页 |
| 4.3.5.3 反应体系pH | 第71-73页 |
| 4.4 小结 | 第73-74页 |
| 第五章 结论与建议 | 第74-76页 |
| 5.1 结论 | 第74-75页 |
| 5.2 建议 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第84页 |
