| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 主要符号对照表 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-24页 |
| 一、 microRNA 简介 | 第14-19页 |
| （一） miRNA 的发现 | 第14页 |
| （二） miRNA 的命名与编号 | 第14-15页 |
| （三） miRNA 的表达及其调控过程 | 第15-17页 |
| （四） miRNA 的作用机制 | 第17-19页 |
| 1. 翻译抑制 | 第17-18页 |
| 2. 降解靶基因 mRNA | 第18页 |
| 3. 转录调控 | 第18页 |
| 4. 介导 ceRNA 调控网络 | 第18页 |
| 5. 其他调控机制 | 第18-19页 |
| 二、 骨肉瘤概述 | 第19-20页 |
| （一） 骨肉瘤的生长与转移 | 第19页 |
| （二） 骨肉瘤新疗法的研究 | 第19-20页 |
| 三、 miRNA 与恶性肿瘤 | 第20-24页 |
| （一） miRNA 作为肿瘤抑制基因 | 第22页 |
| （二） miRNA 作为促癌基因 | 第22页 |
| （三） miRNA 可能同时作为抑癌基因和促癌基因 | 第22-23页 |
| （四） miRNA 与骨肉瘤 | 第23-24页 |
| 第一部分 miR 422a 在骨肉瘤发生中的表达模式及其机制研究 | 第24-36页 |
| 一、 材料与方法 | 第24-32页 |
| （一） 实验对象 | 第24页 |
| （二） 细胞培养、冻存与复苏 | 第24-25页 |
| （三） 实验试剂 | 第25页 |
| （四） 实验仪器 | 第25-26页 |
| （五） 骨肉瘤和癌旁正常组织 microRNA 芯片分析 | 第26-28页 |
| 1. 样品 RNA 抽提 | 第26页 |
| 2. RNA 质量检测（使用 2 种方案） | 第26页 |
| 3. 制备荧光标记探针 | 第26页 |
| 4. 芯片杂交 | 第26页 |
| 5. 图像采集和数据分析 | 第26页 |
| 6. 芯片结果分析 | 第26-28页 |
| （六） 实时荧光定量 PCR（Real time PCR）检测 | 第28-30页 |
| 1. 组织中总 RNA 的抽提 | 第28页 |
| 2. 总 RNA 浓度与纯度测定 | 第28-29页 |
| 3. 逆转录 cDNA | 第29页 |
| 4. 实时荧光定量 PCR 检测目的基因表达 | 第29-30页 |
| 5. 组织及细胞内目的基因相对表达量分析 | 第30页 |
| （七） 染色质免疫共沉淀 | 第30-32页 |
| 1. 在体内交联和裂解 | 第30-31页 |
| 2. DNA 的超声处理 | 第31页 |
| 3. 免疫沉淀（IP）交联蛋白质/ DNA | 第31页 |
| 4. 蛋白质/ DNA 复合物的洗脱 | 第31页 |
| 5. 反向交联的蛋白质/ DNA 复合物，游离 DNA | 第31页 |
| 6. DNA 纯化离心柱 | 第31-32页 |
| 7. PCR 分析 | 第32页 |
| （八） 统计学分析处理 | 第32页 |
| 二、 结果 | 第32-35页 |
| （一） miR 422a 在骨肉瘤细胞系及临床样本中表达下调 | 第32-33页 |
| （二） miR 422a 在骨肉瘤中下调机制研究 | 第33-35页 |
| 三、 小结 | 第35-36页 |
| 第二部分 miR 422a 高表达抑制骨肉瘤细胞抗凋亡并抑制增殖 | 第36-44页 |
| 一、 材料和方法 | 第36-38页 |
| （一） 实验对象 | 第36页 |
| （二） 实验试剂 | 第36-37页 |
| （三） 实验仪器 | 第37页 |
| （四） 骨肉瘤细胞的转染 | 第37页 |
| （五） 细胞周期检测 | 第37页 |
| （六） 流式细胞仪检测细胞凋亡—Annexin V/PI 双染色法 | 第37-38页 |
| （七） 统计学分析处理 | 第38页 |
| 二、 结果 | 第38-43页 |
| （一） miR 422a 生理作用研究 | 第38-40页 |
| （二） miR 422a 低表达促进骨肉瘤细胞生长的机制研究 | 第40-43页 |
| 三、 小结 | 第43-44页 |
| 第三部分 miR 422a 靶点预测与验证 | 第44-59页 |
| 一、 材料与方法 | 第44-49页 |
| （一） 实验试剂 | 第44-45页 |
| （二） 实验仪器 | 第45页 |
| （三） 蛋白抽提与 Western blot | 第45-46页 |
| （四） miR 422a 靶点预测 | 第46页 |
| （五） 3’UTR 报告基因分析 | 第46-48页 |
| 1、报告质粒构建和提取 | 第46-47页 |
| 2、HEK 293 细胞的培养与转染 | 第47页 |
| 3、双荧光检测 | 第47-48页 |
| （六） 实时定量 RT PCR(quanlitative RT PCR) | 第48页 |
| （七） 细胞凋亡与细胞周期检测 | 第48页 |
| （八） siRNA 的设计与合成 | 第48-49页 |
| （九） 统计学分析 | 第49页 |
| 二、 结果 | 第49-54页 |
| （一） miR 422a 靶点预测与验证 | 第49-52页 |
| （二） miR 422a 靶基因的 rescue 实验验证 | 第52-54页 |
| 三、 小结 | 第54-56页 |
| 四、 分析与讨论 | 第56-59页 |
| 结论与意义 | 第59-60页 |
| 综述 | 第60-72页 |
| 一、 骨肉瘤的诊断与治疗 | 第60-65页 |
| （一） 骨肉瘤的临床特点 | 第60页 |
| （二） 骨肉瘤的诊断 | 第60-61页 |
| （三） 新辅助化疗 | 第61-62页 |
| （四） 手术治疗的进展 | 第62-65页 |
| 1、假体重建恢复关节功能 | 第63页 |
| 2、异体骨重建 | 第63-64页 |
| 3、自体骨重建 | 第64页 |
| 4、肿瘤骨的原位灭活重建 | 第64-65页 |
| 二、 骨肉瘤转移分子机制研究 | 第65-72页 |
| （一） 肿瘤细胞的脱落和转移 | 第65-66页 |
| （二） 在循环系统中保持活性 | 第66页 |
| （三） 肿瘤细胞具有抗凋亡的功能 | 第66-67页 |
| （四） 肿瘤细胞在循环系统中逃避免疫监视 | 第67-68页 |
| （五） 转移肿瘤细胞突破靶器官血管并停留 | 第68-69页 |
| （六） Ezrin 蛋白在肿瘤细胞粘附中的作用 | 第69页 |
| （七） 肿瘤休眠假说 | 第69-70页 |
| （八） 肿瘤细胞的增殖 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-84页 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
