| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略词表 | 第7-8页 |
| 目录 | 第8-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-22页 |
| ·概述 | 第11-13页 |
| ·异淀粉酶的研究进展 | 第13-18页 |
| ·异淀粉酶的结构与催化机理 | 第13-16页 |
| ·异淀粉酶产生菌种 | 第16-17页 |
| ·异淀粉酶的基因工程研究 | 第17-18页 |
| ·异淀粉酶的应用 | 第18-19页 |
| ·耐热淀粉酶 | 第19-20页 |
| ·芽孢杆菌生产异淀粉酶 | 第20页 |
| ·本课题的立题依据及研究内容 | 第20-22页 |
| 第二章 基因工程改造地衣芽孢杆菌表达宿主 | 第22-38页 |
| ·前言 | 第22-23页 |
| ·材料与方法 | 第23-27页 |
| ·菌株，质粒和引物 | 第23-24页 |
| ·工具酶和试剂 | 第24页 |
| ·培养基与培养方法 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第25页 |
| ·芽孢杆菌的转化 | 第25-26页 |
| ·主要仪器 | 第26页 |
| ·生物量测定 | 第26页 |
| ·葡萄糖浓度测定 | 第26页 |
| ·α-淀粉酶活测定 | 第26页 |
| ·蛋白酶活测定 | 第26-27页 |
| ·寡糖的高压液相色谱分析 | 第27页 |
| ·结果与讨论 | 第27-37页 |
| ·传递质粒在地衣芽孢杆菌中温度敏感性测试 | 第27-28页 |
| ·淀粉酶基因失活传递质粒的构建 | 第28-29页 |
| ·地衣芽孢杆菌ATCC 14580 amyL基因的失活 | 第29-32页 |
| ·重组地衣芽孢杆菌发酵及α-淀粉酶活检测 | 第32-33页 |
| ·蛋白酶基因失活传递质粒的构建 | 第33-35页 |
| ·地衣芽孢杆菌ATCC 14580 aprE基因的失活 | 第35-37页 |
| ·重组地衣芽孢杆菌发酵及蛋白酶活检测 | 第37页 |
| ·本章小结 | 第37-38页 |
| 第三章 异淀粉酶的质谱鉴定和编码基因的克隆 | 第38-54页 |
| ·前言 | 第38-39页 |
| ·材料与方法 | 第39-43页 |
| ·菌株和质粒 | 第39页 |
| ·工具酶和试剂 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39-40页 |
| ·主要仪器 | 第40页 |
| ·细菌基因组DNA的提取 | 第40页 |
| ·DNA含量的测定 | 第40页 |
| ·PCR所用寡核苷酸引物和程序 | 第40-41页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第41页 |
| ·核苷酸序列测定方法 | 第41页 |
| ·SDS-PAGE | 第41页 |
| ·变性蛋白的胶内酶解 | 第41-42页 |
| ·nanoLC-ESI-Q-TOF/MS/MS鉴定 | 第42页 |
| ·质谱结果分析 | 第42页 |
| ·基因克隆 | 第42-43页 |
| ·结果与讨论 | 第43-53页 |
| ·CICIM304 菌株的鉴定 | 第43-44页 |
| ·异淀粉酶纯酶的nanoLC-ESI-Q-TOF/MS/MS分析结果 | 第44-51页 |
| ·B. lentus 异淀粉酶基因的克隆 | 第51-53页 |
| ·本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 异淀粉酶基因的功能鉴定 | 第54-73页 |
| ·前言 | 第54-56页 |
| ·材料与方法 | 第56-59页 |
| ·菌株和质粒 | 第56页 |
| ·工具酶和试剂 | 第56页 |
| ·培养基 | 第56页 |
| ·主要仪器 | 第56页 |
| ·B. lentus基因组DNA的提取 | 第56页 |
| ·寡核苷酸引物 | 第56-57页 |
| ·SDS-PAGE | 第57页 |
| ·大肠杆菌表达载体的构建 | 第57页 |
| ·异淀粉酶在大肠杆菌中的表达及粗酶液制备 | 第57页 |
| ·酶活测定 | 第57-58页 |
| ·重组异淀粉酶的纯化 | 第58页 |
| ·重组异淀粉酶基本酶学性质 | 第58-59页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第59页 |
| ·结果与讨论 | 第59-71页 |
| ·B. lentus 异淀粉酶大肠杆菌表达载体的构建 | 第59-60页 |
| ·iam1 的功能鉴定 | 第60-61页 |
| ·iam1 及其推衍氨基酸比对分析 | 第61-66页 |
| ·重组异淀粉酶的纯化 | 第66-67页 |
| ·温度和pH对重组异淀粉酶的影响 | 第67-68页 |
| ·化学物质对异淀粉酶的影响 | 第68-70页 |
| ·重组异淀粉酶动力学常数的测定 | 第70-71页 |
| ·重组异淀粉酶对不同底物的特异性 | 第71页 |
| ·本章小结 | 第71-73页 |
| 第五章 半理性设计改造异淀粉酶 | 第73-84页 |
| ·前言 | 第73页 |
| ·材料与方法 | 第73-76页 |
| ·菌株，质粒和引物 | 第73-74页 |
| ·突变引物 | 第74-75页 |
| ·工具酶和试剂 | 第75页 |
| ·分子操作 | 第75-76页 |
| ·培养基与培养条件 | 第76页 |
| ·主要仪器 | 第76页 |
| ·重组异淀粉酶的酶活测定 | 第76页 |
| ·重组异淀粉酶的纯化 | 第76页 |
| ·重组异淀粉酶酶学性质及反应动力学常数测定 | 第76页 |
| ·结果 | 第76-83页 |
| ·异淀粉酶关键氨基酸的确定 | 第76页 |
| ·异淀粉酶基因的最小化处理 | 第76-77页 |
| ·异淀粉酶基因关键氨基酸突变结果 | 第77-78页 |
| ·异淀粉酶突变位点的选取 | 第78-79页 |
| ·异淀粉酶突变体的获得 | 第79页 |
| ·异淀粉酶突变体在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第79-80页 |
| ·异淀粉酶突变体酶活及动力学常数的测定 | 第80-81页 |
| ·突变对酶热稳定性的影响 | 第81-82页 |
| ·突变对酶pH稳定性的影响 | 第82-83页 |
| ·本章小结 | 第83-84页 |
| 第六章 重组地衣芽孢杆菌高效表达异淀粉酶 | 第84-101页 |
| ·前言 | 第84页 |
| ·材料与方法 | 第84-86页 |
| ·菌株、质粒和引物 | 第84-85页 |
| ·工具酶和试剂 | 第85页 |
| ·培养基和培养条件 | 第85页 |
| ·主要仪器 | 第85-86页 |
| ·摇瓶发酵试验 | 第86页 |
| ·异淀粉酶酶活测定 | 第86页 |
| ·SDS-PAGE | 第86页 |
| ·寡糖的高压液相色谱分析 | 第86页 |
| ·结果与讨论 | 第86-99页 |
| ·iam1 基因常用限制性酶切位点的消除 | 第86-87页 |
| ·芽孢杆菌表达质粒的构建及异淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第87-89页 |
| ·异淀粉酶在解淀粉芽孢杆菌中的表达及酶活鉴定 | 第89-91页 |
| ·异淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的表达及酶活鉴定 | 第91-93页 |
| ·重组异淀粉酶酶活的定量分析 | 第93-94页 |
| ·异淀粉酶在双基因失活菌株中的表达 | 第94-95页 |
| ·重组菌质粒遗传稳定性 | 第95-96页 |
| ·15 L 发酵罐分批发酵产异淀粉酶 | 第96-97页 |
| ·重组异淀粉酶与商品细菌普鲁兰酶脱枝作用比较 | 第97-98页 |
| ·重组异淀粉酶应用评价 | 第98-99页 |
| ·本章小结 | 第99-101页 |
| 结论 | 第101-103页 |
| 论文创新点 | 第103-104页 |
| 致谢 | 第104-106页 |
| 参考文献 | 第106-116页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第116页 |
