| 缩略语表 | 第1-8页 |
| 中文摘要 | 第8-9页 |
| 英文摘要 | 第9-11页 |
| 前言 | 第11-14页 |
| 实验流程 | 第14-15页 |
| 第一部分:人巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)表达质粒的构建及其在毕赤酵母中的优化表达 | 第15-43页 |
| 材料与方法 | 第16-33页 |
| 一、实验材料 | 第16-17页 |
| 二、主要试剂 | 第17-21页 |
| 三、主要仪器 | 第21页 |
| 四、实验方法 | 第21-33页 |
| 1、MIC-1重组蛋白表达载体的构建 | 第21-28页 |
| ·、提取人胎盘组织总RNA | 第22页 |
| ·、RT-PCR法获得wtMIC-1 cDNA基因片断 | 第22-24页 |
| ·、wtMIC-1 cDNA PCR产物的序列测定 | 第24页 |
| ·、PCR法获得mtMIC-1 cDNA基因片断 | 第24页 |
| ·、pPIC9和pPIC9K质粒的小量制备 | 第24-25页 |
| ·、pPIC9质粒和mtMIC-1基因的酶切与回收 | 第25页 |
| ·、mtMIC-1基因酶切片段和pPIC9质粒酶切片段的连接 | 第25-26页 |
| ·、感受态大肠杆菌的制备(氯化钙法) | 第26页 |
| ·、pPIC9-mtMIC-1连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第26页 |
| ·、重组pPIC9-mtMIC-1质粒酶切鉴定 | 第26页 |
| ·、重组pPIC9-mtMIC-1质粒的序列测定 | 第26-27页 |
| ·、重组pPIC9-mtMIC-1质粒和pPIC9K质粒酶切与回收 | 第27页 |
| ·、重组pPIC9-mtMIC-1质粒双酶切mtMIC-1基因片段和pPIC9K质粒酶切片段的连接 | 第27页 |
| ·、pPIC9K-mtMIC-1连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第27页 |
| ·、重组pPIC9K-mtMIC-1质粒酶切鉴定 | 第27页 |
| ·、重组pPIC9K-mtMIC-1质粒的序列测定 | 第27-28页 |
| 2、重组pPIC9K-mtMIC-1质粒转染GS115工程菌并诱导表达 | 第28-29页 |
| ·、重组pPIC9K-mtMIC-1质粒转染感受态GS115菌株 | 第28页 |
| ·、G418抗性筛选多拷贝的重组克隆 | 第28-29页 |
| ·、重组GS115菌株中的诱导表达 | 第29页 |
| 3、重组pPIC9K-mtMIC-1毕赤酵母菌株的筛选和鉴定 | 第29-33页 |
| ·、SDS-PAGE电泳样品的还原及非还原处理 | 第29-30页 |
| ·、SDS-PAGE电泳检测表达产物及凝胶的染色 | 第30-31页 |
| ·、Western blotting检测蛋白表达 | 第31页 |
| ·、重组菌株表达条件的优化 | 第31-32页 |
| ·、MIC-1重组GS115菌株的发酵及发酵条件的初步优化 | 第32-33页 |
| 结果 | 第33-39页 |
| 一、MIC-1重组蛋白表达载体的构建 | 第33-35页 |
| 1、提取人胎盘组织总RNA | 第33页 |
| 2、wt MIC-1和mtMIC-1 cDNA的PCR扩增结果 | 第33-34页 |
| 3、重组pPIC9-mtMIC-1质粒和pPIC9K-mtMIC-1质粒的酶切鉴定 | 第34页 |
| 4、重组pPIC9-mtMIC-1质粒的测序鉴定 | 第34-35页 |
| 二、重组GS115稳定表达菌株的筛选和鉴定 | 第35-39页 |
| 1、重组GS115菌株表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定 | 第35-36页 |
| 2、重组GS115菌株表达产物的Western blotting鉴定 | 第36页 |
| 3、重组菌株MIC-1表达条件的优化 | 第36-39页 |
| ·、不同甲醇浓度对MIC-1表达的影响 | 第36-37页 |
| ·、不同诱导时间对MIC-1表达的影响 | 第37-39页 |
| 讨论 | 第39-43页 |
| 第二部分:MIC-1重组蛋白的初步纯化工艺研究 | 第43-57页 |
| 材料与方法 | 第44-50页 |
| 一、主要试剂 | 第44-45页 |
| 二、主要仪器 | 第45页 |
| 三、实验方法 | 第45-50页 |
| 1、样品的处理及硫酸铵沉淀 | 第45-46页 |
| 2、G25凝胶过滤层析脱盐 | 第46页 |
| 3、Source 30Q阴离子交换层析连续梯度洗脱 | 第46-47页 |
| 4、Source 30Q阴离子交换层析阶梯梯度洗脱 | 第47页 |
| 5、G25凝胶过滤层析脱盐 | 第47页 |
| 6、冻干 | 第47页 |
| 7、MIC-1重组蛋白的定量 | 第47-48页 |
| ·、使用PIERCE BCA蛋白定量法(试剂盒) | 第47-48页 |
| ·、使用ELISA双抗体夹心法定量(试剂盒) | 第48页 |
| 8、SDS-PAGE电泳检测MIC-1重组蛋白的纯度 | 第48-50页 |
| 结果 | 第50-54页 |
| 1、硫酸铵沉淀 | 第50页 |
| 2、G25凝胶过滤层析脱盐 | 第50页 |
| 3、Source 30Q阴离子交换层析连续梯度洗脱 | 第50-51页 |
| 4、Source 30Q阴离子交换层析阶梯梯度洗脱 | 第51-52页 |
| 5、冻干 | 第52-53页 |
| 6、MIC-1重组蛋白的定量 | 第53页 |
| 7、SDS-PAGE电泳检测重组MIC-1纯度 | 第53-54页 |
| 讨论 | 第54-57页 |
| 第三部分:抗MIC-1蛋白多克隆抗体的制备 | 第57-64页 |
| 材料与方法 | 第58-61页 |
| 一、主要试剂 | 第58页 |
| 二、仪器及器材 | 第58页 |
| 三、实验动物 | 第58页 |
| 四、实验方法 | 第58-61页 |
| 1、动物及抗原的准备 | 第58页 |
| 2、免疫动物 | 第58-59页 |
| 3、血清抗体效价的检测 | 第59-60页 |
| ·、双向琼脂扩散法 | 第59页 |
| ·、ELISA法 | 第59-60页 |
| 4、免疫动物抗血清的采集与保存 | 第60页 |
| 5、抗血清特异性的评价(Western blotting法) | 第60-61页 |
| 结果 | 第61-63页 |
| 1、血清抗体效价的检测 | 第61页 |
| 2、抗血清特异性的评价 | 第61-63页 |
| 讨论 | 第63-64页 |
| 结论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-69页 |
| 综述 | 第69-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
