| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-9页 |
| 1 绪论 | 第9-34页 |
| ·α-淀粉酶概述 | 第9-20页 |
| ·α-淀粉酶的结构特点 | 第10-13页 |
| ·α-淀粉酶的性质 | 第13-16页 |
| ·α-淀粉酶的工业应用 | 第16-20页 |
| ·α-淀粉酶基因克隆表达研究进展 | 第20-24页 |
| ·α-淀粉酶基因的克隆 | 第20-21页 |
| ·α-淀粉酶基因的表达 | 第21-24页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第24-25页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第25-32页 |
| ·毕赤酵母表达系统的优点 | 第26页 |
| ·毕赤酵母表达宿主菌 | 第26页 |
| ·表达载体 | 第26-27页 |
| ·外源蛋白在毕赤酵母中的表达 | 第27-31页 |
| ·毕赤酵母表达系统的应用 | 第31-32页 |
| ·课题研究目的和意义 | 第32-34页 |
| 2 产 α-淀粉酶菌株分离纯化及其酶学性质 | 第34-48页 |
| ·实验材料 | 第34-35页 |
| ·样品的采集 | 第34页 |
| ·设备与试剂 | 第34-35页 |
| ·实验方法 | 第35-39页 |
| ·筛选培养基 | 第35页 |
| ·筛选方法 | 第35-36页 |
| ·活性测定方法 | 第36-37页 |
| ·菌株形态的显微观察 | 第37页 |
| ·16S rDNA 的PCR 扩增 | 第37-38页 |
| ·产酶条件及发酵液处理 | 第38页 |
| ·酶学性质研究 | 第38-39页 |
| ·米氏常数测定 | 第39页 |
| ·结果与分析 | 第39-46页 |
| ·葡萄糖标准曲线的绘制 | 第39-40页 |
| ·菌株筛选 | 第40页 |
| ·菌种鉴定 | 第40-42页 |
| ·酶学性质 | 第42-45页 |
| ·米氏常数Km | 第45-46页 |
| ·讨论 | 第46-48页 |
| 3 α-淀粉酶基因的克隆及原核表达 | 第48-59页 |
| ·实验材料 | 第48-49页 |
| ·菌株与质粒 | 第48页 |
| ·酶和试剂 | 第48-49页 |
| ·主要仪器 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-53页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第49页 |
| ·质粒DNA 的制备 | 第49-50页 |
| ·DNA 的酶切、连接与转化 | 第50页 |
| ·目的基因的PCR 扩增 | 第50-51页 |
| ·目的基因的A/T 克隆及转化 | 第51页 |
| ·重组菌株的诱导表达 | 第51页 |
| ·重组蛋白的酶活力测定和表达产物SDS-PAGE 分析 | 第51-53页 |
| ·结果与分析 | 第53-58页 |
| ·目的基因的克隆 | 第53-54页 |
| ·目的片段同源性分析 | 第54-55页 |
| ·重组质粒pET28-Amy 的构建 | 第55-57页 |
| ·α-淀粉酶的酶活力测定和表达产物SDS-PAGE 分析 | 第57-58页 |
| ·讨论 | 第58-59页 |
| 4 α-淀粉酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达 | 第59-70页 |
| ·实验材料 | 第59-60页 |
| ·菌株和质粒 | 第59页 |
| ·酶和试剂 | 第59-60页 |
| ·主要仪器 | 第60页 |
| ·实验方法 | 第60-62页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第60页 |
| ·毕赤酵母的LiCl 转化法 | 第60-61页 |
| ·α-淀粉酶基因PCR 扩增 | 第61页 |
| ·DNA 的酶切、连接与转化 | 第61页 |
| ·重组毕赤酵母的表型筛选、拷贝数确定及功能检测 | 第61-62页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达 | 第62页 |
| ·重组蛋白的酶活力测定和SDS-PAGE 分析 | 第62页 |
| ·结果与分析 | 第62-68页 |
| ·α-淀粉酶基因的克隆 | 第62-63页 |
| ·重组质粒pPIC9K-Amy 的构建 | 第63-65页 |
| ·重组菌株的PCR 扩增和酶切验证 | 第65页 |
| ·重组酵母菌株的获得 | 第65-66页 |
| ·重组菌株Muts 表型、拷贝数确定和功能验证 | 第66-67页 |
| ·重组菌株的诱导表达 | 第67页 |
| ·表达产物SDS-PAGE 分析 | 第67-68页 |
| ·讨论 | 第68-70页 |
| 5 全文小结和展望 | 第70-71页 |
| ·全文小结 | 第70页 |
| ·展望 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-82页 |
| 附录1 攻读学位期间发表论文目录 | 第82页 |