| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-7页 |
| 第一部分 文献综述 | 第7-17页 |
| 1 几丁质、几丁质酶及几丁质酶的分布 | 第7-8页 |
| 2 几丁质酶的分类和结构 | 第8-10页 |
| 3 几丁质酶的作用 | 第10页 |
| 4 几丁质酶的酶活测定方法 | 第10页 |
| 5 几丁质酶的应用 | 第10-11页 |
| 6 杆状病毒几丁质酶简述 | 第11-14页 |
| 7 本研究的目的、意义、内容和技术路线 | 第14-17页 |
| 第二部分 原核的构建与表达研究 | 第17-31页 |
| 第一章 原核克隆表达常用方法和一般操作步骤 | 第17-25页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第17-18页 |
| ·酶切 | 第18页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳检测和回收 | 第18-19页 |
| ·T4 DNA-LIGNASE连接 | 第19页 |
| ·感受态细胞的制备(CACL2法) | 第19-20页 |
| ·转化 | 第20页 |
| ·PCR扩增鉴定(菌落和质粒) | 第20-21页 |
| ·蛋白质的检测——SDS—PAGE凝胶电泳 | 第21-22页 |
| ·蛋白印迹(WESTERN BLOT) | 第22-23页 |
| ·几丁质酶酶活的测定 | 第23-24页 |
| ·周质分泌产物的提取 | 第24-25页 |
| 第二章 HASNPV几丁质酶基因的原核表达 | 第25-31页 |
| ·材料 | 第25-26页 |
| ·实验方法 | 第26页 |
| ·结果及分析 | 第26-29页 |
| ·讨论 | 第29-31页 |
| 第三部分 真核的构建和表达研究 | 第31-51页 |
| 第一章 毕赤酵母多拷贝表达载体简介 | 第31-35页 |
| ·毕赤酵母是甲醇营养型酵母 | 第32页 |
| ·两种醇氧化酶蛋白及AOX1突变表型 | 第32页 |
| ·表达 | 第32页 |
| ·蛋白胞内及分泌表达 | 第32-33页 |
| ·基因多拷贝整合 | 第33-35页 |
| 第二章 真核克隆表达常用方法和一般操作步骤 | 第35-43页 |
| ·合成新扩增引物 | 第35页 |
| ·目的基因的扩增 | 第35页 |
| ·PCR产物胶回收 | 第35页 |
| ·目的基因与PMD18-T-VECTER连接 | 第35-36页 |
| ·制备E.COLI DH5A感受态 | 第36页 |
| ·转化过夜连接产物 | 第36页 |
| ·转化产物的筛选 | 第36页 |
| ·对构建质粒(PMD18-T-VECTER-CHIA)和表达质粒(PPIC9K)进行分步酶切并回收酶切产物 | 第36-37页 |
| ·连接目的基因和线性化的表达质粒 | 第37页 |
| ·转化连接产物 | 第37页 |
| ·对连接产物进行复筛 | 第37页 |
| ·合成测序引物 | 第37页 |
| ·用测序引物进行PCR鉴定 | 第37页 |
| ·DNA测序 | 第37-38页 |
| ·毕赤酵母GS115的培养与保存 | 第38页 |
| ·毕赤酵母GS115感受态的制备 | 第38-39页 |
| ·含目的基因的表达质粒和亲本质粒的线性化 | 第39-40页 |
| ·电转化GS115感受态细胞 | 第40页 |
| ·转化产物的筛选(筛选MUT+或MUTS转化子) | 第40页 |
| ·筛选多拷贝克隆—筛选抗高浓度遗传霉素(G418)克隆 | 第40-41页 |
| ·PCR法鉴定转化子 | 第41页 |
| ·浓缩蛋白—硫酸铵沉淀法 | 第41-42页 |
| ·表达菌株的初步诱导表达(MUT+的分泌型) | 第42-43页 |
| 第三章 HASNPV几丁质酶基因的真核构建和表达 | 第43-51页 |
| ·材料 | 第43-44页 |
| ·实验方法 | 第44-45页 |
| ·结果与分析 | 第45-50页 |
| ·讨论 | 第50-51页 |
| 第四部分 结论 | 第51-53页 |
| 主要结论 | 第51页 |
| 主要创新点 | 第51-52页 |
| 研究展望 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-56页 |
| 附录 | 第56-67页 |
| 致谢 | 第67页 |