| 摘要 | 第1-15页 |
| Abstract | 第15-18页 |
| 第一部分 文献综述 | 第18-47页 |
| 一、鱼类的免疫系统和免疫机制 | 第19-23页 |
| 1.鱼类的特异性免疫系统 | 第19页 |
| ·鱼类特异性体液免疫 | 第19页 |
| ·鱼类特异性细胞免疫 | 第19页 |
| 2.鱼类的非特异性免疫系统 | 第19-20页 |
| ·鱼类非特异性体液免疫 | 第19-20页 |
| ·鱼类非特异性细胞免疫 | 第20页 |
| 3.鱼类免疫应答的基本过程 | 第20-23页 |
| 二、鱼类病害的免疫预防——历史及现状 | 第23-27页 |
| (一) 鱼类疫苗的种类 | 第23-26页 |
| 1.传统疫苗 | 第23-24页 |
| ·灭活疫苗 | 第23-24页 |
| ·减毒疫苗 | 第24页 |
| ·亚单位疫苗 | 第24页 |
| 2.基因工程疫苗 | 第24-26页 |
| ·基因工程亚单位疫苗 | 第24页 |
| ·基因工程减毒活疫苗 | 第24-25页 |
| ·基因工程活载体疫苗 | 第25页 |
| ·DNA疫苗 | 第25-26页 |
| (二) 鱼用疫苗研究现状 | 第26-27页 |
| 三、病原体的保护性抗原及其筛选方法 | 第27-37页 |
| (一) 革兰氏阴性菌外膜蛋白的结构与生物学功能 | 第27-36页 |
| 1.外膜蛋白的组成、结构及功能 | 第28-31页 |
| ·OmpA蛋白 | 第28-29页 |
| ·微孔蛋白 | 第29-31页 |
| ·脂蛋白 | 第31页 |
| ·微量蛋白 | 第31页 |
| 2、Omp的致病作用 | 第31-32页 |
| 3.受体功能 | 第32-33页 |
| 4.Omp的免疫保护作用 | 第33-35页 |
| 5、Omp与LPS相互作用 | 第35页 |
| 6、外膜蛋白应用前景展望 | 第35-36页 |
| (二) 抗原性基因筛选方法 | 第36-37页 |
| 1.表达文库免疫技术 | 第36页 |
| 2.噬菌体表面展示技术 | 第36页 |
| 3.反向疫苗学 | 第36-37页 |
| 4.免疫蛋白质组学 | 第37页 |
| 四、蛋白质质谱分析研究进展 | 第37-40页 |
| 1.质谱分析的特点 | 第37页 |
| 2.质谱分析的方法 | 第37-38页 |
| 3.蛋白质的质谱分析 | 第38-40页 |
| ·蛋白质的质谱分析原理 | 第38页 |
| ·蛋白质和肽的序列分析 | 第38-39页 |
| ·蛋白质的质谱分析方式 | 第39-40页 |
| ·蛋白消化 | 第39页 |
| ·基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS) | 第39-40页 |
| ·电子喷雾电离质谱测量法 | 第40页 |
| 五、鱼类免疫学及疫苗学的发展趋势 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-47页 |
| 第二部分 研究内容 | 第47-127页 |
| 第一章 概述 | 第48-56页 |
| ·研究的背景及意义 | 第48-50页 |
| ·主要研究内容 | 第50-51页 |
| ·研究技术路线 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-56页 |
| 第二章 哈维氏弧菌外膜蛋白ompK基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶gapdh基因的克隆 | 第56-72页 |
| ·引言 | 第56-57页 |
| ·材料 | 第57页 |
| ·方法 | 第57-62页 |
| ·哈维氏弧菌总DNA的提取 | 第57页 |
| ·引物设计 | 第57-58页 |
| ·ompK基因引物 | 第57页 |
| ·gapdh基因引物 | 第57-58页 |
| ·基因扩增 | 第58-59页 |
| ·ompK基因扩增 | 第58页 |
| ·gapdh基因扩增 | 第58-59页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第59页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第59-60页 |
| ·T载体与PCR产物的连接 | 第60页 |
| ·转化及蓝白斑筛选阳性克隆 | 第60页 |
| ·碱裂解法小量制备重组质粒 | 第60-61页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第61-62页 |
| (1) 重组质粒的酶切鉴定 | 第61页 |
| (2) 重组质粒的PCR鉴定 | 第61-62页 |
| (3) 重组质粒的测序鉴定 | 第62页 |
| ·信号序列预测 | 第62页 |
| ·结果 | 第62-66页 |
| ·ompK和gapdh基因的克隆结果 | 第62页 |
| ·pGEM-T-ompK和pGEM-T-gapdh的酶切鉴定结果 | 第62-63页 |
| ·pGEM-T-ompK和pGEM-T-gapdh的PCR鉴定结果 | 第63-64页 |
| ·pGEM-T-ompK和pGEM-T-gapdh的测序鉴定 | 第64页 |
| ·信号肽分析结果 | 第64-65页 |
| ·pGEM-T-gapdh的测序鉴定 | 第65-66页 |
| ·结果分析与讨论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-72页 |
| 第三章 ompK和gapdh及其融合基因ompK-gapdh原核表达载体的构建与表达 | 第72-87页 |
| ·引言 | 第72页 |
| ·材料 | 第72页 |
| ·质粒和菌株 | 第72页 |
| ·主要试剂 | 第72页 |
| ·主要仪器 | 第72页 |
| ·方法 | 第72-79页 |
| ·引物设计 | 第72-73页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第73-77页 |
| ·缺失信号肽序列的ompK基因片段的克隆 | 第73页 |
| ·gapdh基因(携带双酶切位点)的克隆 | 第73-74页 |
| ·重叠延伸基因拼接(SOEing)扩增融合基因 | 第74-77页 |
| 1) 重叠延伸基因拼接扩增(SOEing)机制 | 第74-75页 |
| 2) 融合片段ompK的克隆 | 第75页 |
| 3) 融合片段gapdh的克隆 | 第75-76页 |
| 4) 基因融合 | 第76-77页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第77页 |
| ·碱裂解法小量制备载体质粒pET-30a(+) | 第77页 |
| ·载体质粒、PCR产物的双酶切 | 第77页 |
| ·载体片段与PCR产物的连接 | 第77页 |
| ·转化及蓝白斑筛选阳性克隆 | 第77页 |
| ·重组蛋白表达条件的优化 | 第77-78页 |
| 1) 表达条件的优化 | 第77-78页 |
| 2) SDS-PAGE | 第78页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第78-79页 |
| 1) 表达方式检测 | 第78页 |
| 2) 纯化 | 第78-79页 |
| ·三维结构模拟 | 第79页 |
| ·结果 | 第79-85页 |
| ·表达基因片段的克隆 | 第79页 |
| ·重组质粒双酶切鉴定结果 | 第79-80页 |
| ·重组质粒测序鉴定结果 | 第80-82页 |
| ·最佳表达温度 | 第82页 |
| ·最佳诱导时间 | 第82页 |
| ·最佳诱导浓度 | 第82-83页 |
| ·重组蛋白的表达方式检测 | 第83页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第83-84页 |
| ·三维结构预测 | 第84-85页 |
| ·结果分析与讨论 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-87页 |
| 第四章 重组蛋白多克隆抗体的制备及免疫印迹反应 | 第87-96页 |
| ·引言 | 第87页 |
| ·材料 | 第87页 |
| ·方法 | 第87-91页 |
| ·多克隆抗体制备及其效价测定 | 第87-89页 |
| 1) 动物免疫 | 第87页 |
| 2) ELISA检测血清抗体效价 | 第87-88页 |
| 3) 血清凝集实验 | 第88-89页 |
| ·哈维氏弧菌外膜蛋白的提取 | 第89-90页 |
| 1) SDS法 | 第89页 |
| 2) Sarkosyl法 | 第89-90页 |
| ·哈维氏弧菌外膜蛋白热可变性研究 | 第90页 |
| 1) SDS-PAGE | 第90页 |
| 2) Western-blotting | 第90页 |
| ·重组外膜蛋白OmpK、GAPDH和OmpK-GAPDH免疫反应性检测 | 第90-91页 |
| 1) 兔抗OmpK血清和兔抗GAPDH血清的稀释和吸附 | 第90-91页 |
| 2) SDS-PAGE和电转印 | 第91页 |
| 3) Western-blotting | 第91页 |
| ·结果 | 第91-94页 |
| ·兔抗r-OmpK,兔抗r-GAPDH多克隆抗体效价测定 | 第91-92页 |
| 1) ELISA检测抗体效价 | 第91-92页 |
| 2) 血清凝集实验结果 | 第92页 |
| ·哈维氏弧菌外膜蛋白热可变性 | 第92-93页 |
| ·重组外膜蛋白OmpK、GAPDH和OmpK-GAPDH免疫反应性 | 第93-94页 |
| ·结果分析与讨论 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-96页 |
| 第五章 r-OMPK和r-GAPDH及r-OMPK-GAPDH免疫原性检测 | 第96-106页 |
| ·引言 | 第96页 |
| ·试剂和材料 | 第96页 |
| ·方法 | 第96-99页 |
| ·大黄鱼 | 第96页 |
| ·免疫 | 第96页 |
| ·采样 | 第96-97页 |
| ·巨噬细胞分离 | 第97页 |
| ·细胞记数和活性测定 | 第97页 |
| ·吞噬活性检测 | 第97-98页 |
| ·ELISA检测抗体效价 | 第98页 |
| ·感染实验 | 第98-99页 |
| 1) 感染菌株的准备 | 第98-99页 |
| 2) 人工感染 | 第99页 |
| ·结果 | 第99-101页 |
| ·结果分析与讨论 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-106页 |
| 第六章 几种弧菌病原株的分子生物学鉴定及其外膜蛋白免疫印迹 | 第106-115页 |
| ·引言 | 第106页 |
| ·菌株、试剂和仪器 | 第106-107页 |
| ·方法 | 第107-109页 |
| ·病原菌的分离 | 第107页 |
| ·病原菌的生化鉴定 | 第107页 |
| ·病原菌的分子生物学鉴定 | 第107-108页 |
| ·病菌DNA抽提 | 第107页 |
| ·引物设计 | 第107页 |
| ·HSP60基因部分序列扩增 | 第107-108页 |
| ·系统进化树分析 | 第108页 |
| ·哈维氏弧菌全菌多抗制备 | 第108页 |
| ·哈维氏弧菌灭活 | 第108页 |
| ·抗血清制备和效价检测 | 第108页 |
| ·哈维氏弧菌外膜蛋白的提取 | 第108页 |
| ·凝胶电泳和免疫印迹 | 第108-109页 |
| ·结果 | 第109-113页 |
| ·病原菌分离和常规鉴定 | 第109-110页 |
| ·HSP60基因部分序列扩增 | 第110页 |
| ·系统进化树分析 | 第110-111页 |
| ·哈维氏弧菌的灭活结果 | 第111-112页 |
| ·抗血清效价检测 | 第112页 |
| ·凝胶电泳和免疫印迹 | 第112-113页 |
| ·结果分析与讨论 | 第113-114页 |
| 参考文献 | 第114-115页 |
| 第七章 三种典型致病弧菌交叉保护性抗原鉴定 | 第115-127页 |
| ·引言 | 第115页 |
| ·仪器和试剂 | 第115-116页 |
| ·方法 | 第116-120页 |
| ·Sarcosyl法抽提外膜蛋白 | 第116页 |
| ·样品处理 | 第116页 |
| ·Bradford法定量 | 第116页 |
| ·IPGIEF | 第116-117页 |
| ·垂直电泳 | 第117-118页 |
| ·Western-blotting | 第118-119页 |
| ·胶内胰酶消化 | 第119页 |
| ·质谱分析 | 第119-120页 |
| ·数据搜索 | 第120页 |
| ·结果 | 第120-123页 |
| ·双向电泳及免疫印迹结果 | 第120-121页 |
| ·质谱分析结果 | 第121-122页 |
| ·搜索数据库结果 | 第122-123页 |
| ·结果分析与讨论 | 第123-125页 |
| 参考文献 | 第125-127页 |
| 第三部分 总结与展望 | 第127-130页 |
| ·结论及主要创新点 | 第128-129页 |
| ·不足与展望 | 第129-130页 |
| 第四部分 附录 | 第130-140页 |
| 附录1 常用试剂及配制 | 第131-137页 |
| 附录2 攻读博士期间发表或录用的学术论文 | 第137-138页 |
| 附录3 GeneBank登录序列一览 | 第138-140页 |
| 致谢 | 第140-141页 |
