| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 英文缩略词表 | 第13-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-28页 |
| ·β-甘露聚糖酶的简介 | 第14-23页 |
| ·β-甘露聚糖酶生产菌的筛选 | 第14页 |
| ·β-甘露聚糖酶的纯化与酶学性质 | 第14-17页 |
| ·β-甘露聚糖酶的基因序列 | 第17-18页 |
| ·β-甘露聚糖酶分子的结构区域 | 第18-20页 |
| ·β-甘露聚糖酶的基因克隆 | 第20-21页 |
| ·β-甘露聚糖酶的基因表达 | 第21-22页 |
| ·β-甘露聚糖酶的应用 | 第22-23页 |
| ·全长cDNA克隆策略 | 第23-25页 |
| ·分泌型载体pPICZaA简介 | 第25页 |
| ·斯德毕赤酵母表达系统简介 | 第25-26页 |
| ·研究的背景、思路及意义 | 第26-28页 |
| 第二章 实验设备及材料 | 第28-34页 |
| ·主要仪器设备 | 第28页 |
| ·实验材料 | 第28-34页 |
| ·菌种及载体 | 第28页 |
| ·培养基 | 第28-31页 |
| ·试剂与母液配制 | 第31-32页 |
| ·酶类 | 第32-33页 |
| ·试剂盒 | 第33页 |
| ·其它 | 第33-34页 |
| 第三章 实验方法 | 第34-57页 |
| ·β-甘露聚糖酶的定性检测 | 第34页 |
| ·诱导培养基优化 | 第34页 |
| ·β-甘露聚糖酶的活力测定 | 第34-35页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第35-36页 |
| ·β-甘露聚糖酶酶的分离和纯化 | 第36-37页 |
| ·酶作用产物分析 | 第37页 |
| ·P2的酶学性质分析 | 第37-40页 |
| ·酶分子量分析 | 第37-38页 |
| ·酶的等电点测定 | 第38-39页 |
| ·温度和pH对酶活力的影响 | 第39页 |
| ·酶的热稳定性和pH稳定性 | 第39页 |
| ·金属离子对酶活力的影响 | 第39-40页 |
| ·总RNA的提取 | 第40页 |
| ·RT-PCR | 第40-45页 |
| ·简并引物设计 | 第40-41页 |
| ·RT-PCR步骤 | 第41-43页 |
| ·切胶回收PCR产物 | 第43页 |
| ·TA克隆 | 第43-45页 |
| ·测序 | 第45页 |
| ·SMART—5’RACE | 第45-48页 |
| ·引物设计 | 第45-46页 |
| ·5’RACE-Ready cDNA的制备 | 第46-47页 |
| ·5’RACE步骤 | 第47-48页 |
| ·切胶回收5’RACE产物 | 第48页 |
| ·TA克隆 | 第48页 |
| ·测序 | 第48页 |
| ·SMART—3’RACE | 第48-50页 |
| ·引物设计 | 第48页 |
| ·3’RACE-Ready cDNA的制备 | 第48-49页 |
| ·3’RACE步骤 | 第49-50页 |
| ·切胶回收3’RACE产物 | 第50页 |
| ·TA克隆 | 第50页 |
| ·测序 | 第50页 |
| ·拼接全长cDNA序列 | 第50页 |
| ·生物信息学分析 | 第50-51页 |
| ·成熟肽全长PCR | 第51-52页 |
| ·成熟肽引物设计 | 第51页 |
| ·成熟肽PCR步骤 | 第51-52页 |
| ·切胶回收成熟肽产物 | 第52页 |
| ·重组质粒pPICZaA-man’的构建 | 第52-54页 |
| ·酶切质粒和目的片断 | 第53页 |
| ·质粒pPICZαA和目的基因man’的连接 | 第53页 |
| ·转化 | 第53页 |
| ·双酶切鉴定重组质粒 | 第53-54页 |
| ·测序 | 第54页 |
| ·毕赤酵母中表达 | 第54-56页 |
| ·线性化质粒 | 第54页 |
| ·电转化毕赤酵母菌GS115 | 第54-55页 |
| ·重组菌定性检测 | 第55页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第55-56页 |
| ·表达产物检测 | 第56页 |
| ·重组β-甘露聚糖酶的酶学性质分析及镍亲和层析纯化 | 第56-57页 |
| ·酶学性质分析 | 第56页 |
| ·镍亲和层析 | 第56-57页 |
| 第四章 实验结果 | 第57-104页 |
| ·β-甘露聚糖酶的定性检测 | 第57页 |
| ·诱导培养基优化 | 第57-58页 |
| ·β-甘露聚糖酶的分离、纯化 | 第58-59页 |
| ·酶作用产物的分析 | 第59-60页 |
| ·P2 β-甘露聚糖酶酶学性质分析 | 第60-63页 |
| ·酶的分子量、等电点测定 | 第60-61页 |
| ·温度和pH对酶活力的影响 | 第61页 |
| ·温度和pH对酶稳定性的影响 | 第61-62页 |
| ·金属离子对酶的影响 | 第62-63页 |
| ·总RNA提取的结果 | 第63-64页 |
| ·RT-PCR结果 | 第64-67页 |
| ·RT-PCR产物的电泳检测 | 第64页 |
| ·pTM1双酶切鉴定 | 第64-65页 |
| ·RT-PCR产物的测序结果 | 第65-66页 |
| ·序列M1的blastx结果 | 第66-67页 |
| ·SMART—5’RACE结果 | 第67-69页 |
| ·5’RACE产物的电泳检测 | 第67-68页 |
| ·pTM2双酶切鉴定 | 第68页 |
| ·5’RACE产物的序列结果 | 第68-69页 |
| ·SMART—3’RACE结果 | 第69-72页 |
| ·3’RACE产物的电泳检测 | 第69-70页 |
| ·pTM3双酶切鉴定 | 第70-71页 |
| ·3’RACE产物的序列结果 | 第71-72页 |
| ·拼接全长cDNA序列 | 第72-73页 |
| ·生物信息学分析 | 第73-96页 |
| ·开放阅读框(ORF)分析 | 第73-76页 |
| ·同源性分析 | 第76-83页 |
| ·一级结构分析 | 第83-87页 |
| ·二级结构和功能分析 | 第87-94页 |
| ·三级结构分析 | 第94-95页 |
| ·序列递交 | 第95-96页 |
| ·β-甘露聚糖酶基因的表达 | 第96-102页 |
| ·成熟肽PCR结果 | 第96-99页 |
| ·pman’在毕赤酵母中的表达 | 第99-102页 |
| ·重组β-甘露聚糖酶的酶学性质 | 第102-103页 |
| ·温度对酶的活力及稳定性的影响 | 第102页 |
| ·pH对酶的活力及稳定性的影 | 第102-103页 |
| ·重组β-甘露聚糖酶镍亲和柱纯化 | 第103-104页 |
| 第五章 讨论 | 第104-110页 |
| ·β-甘露聚糖酶的定性检测和产酶培养基的优化 | 第104页 |
| ·纯化及酶学性质分析 | 第104-105页 |
| ·基因克隆及生物信息学分析 | 第105-108页 |
| ·简并引物设计 | 第105-106页 |
| ·基因克隆 | 第106-107页 |
| ·生物信息学分析 | 第107-108页 |
| ·毕赤酵母中表达、纯化 | 第108-110页 |
| 小结和展望 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-118页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及获奖情况 | 第118-119页 |
| 致谢 | 第119页 |