| 目录 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 前言 | 第13-25页 |
| 第一章 D-乙内酰脲酶产酶新菌株的筛选 | 第25-30页 |
| 1 材料 | 第25-26页 |
| ·底物和培养基： | 第25页 |
| ·试剂 | 第25-26页 |
| ·仪器 | 第26页 |
| 2 方法 | 第26页 |
| ·酶活性的定性检测：采用薄层层析法(TLC)。 | 第26页 |
| ·革兰氏染色方法 | 第26页 |
| 3 结果 | 第26-29页 |
| ·菌种筛选模型的建立 | 第26-27页 |
| ·菌种的筛选 | 第27-28页 |
| ·菌种的鉴定 | 第28-29页 |
| 4 讨论 | 第29-30页 |
| 第二章 耐热的D-乙内酰脲水解酶基因合成 | 第30-41页 |
| 1 材料 | 第30-33页 |
| ·菌种和质粒 | 第30页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第30页 |
| ·引物 | 第30-32页 |
| ·试剂 | 第32页 |
| ·主要仪器 | 第32-33页 |
| 2 方法 | 第33-35页 |
| ·PCR连接基因 | 第33页 |
| ·质粒pQE60S-hyuC的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第33-34页 |
| ·质粒pQE60S-SD1的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第34页 |
| ·阳性克隆的检测 | 第34页 |
| ·乙内酰脲水解酶活性的检测 | 第34页 |
| ·乙内酰脲水解酶活力的测定 | 第34-35页 |
| ·定点突变纠正错误碱基 | 第35页 |
| 3 结果 | 第35-39页 |
| ·乙内酰脲水解酶基因的PCR连接 | 第35页 |
| ·错误碱基的定点突变 | 第35页 |
| ·表达质粒pQE60S-hyuC的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第35-37页 |
| ·pQE60S-hyuC表达产物的SDS-PAGE检测 | 第37页 |
| ·DH5α／pQE60S-hyuC表达产物的生物学活性分析 | 第37页 |
| ·表达质粒pQE60S-SD1的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第37-38页 |
| ·pQE60S-SD1的表达产物SDS-PAGE检测 | 第38页 |
| ·表达产物的生物学活性分析 | 第38-39页 |
| ·表达产物的生物活性定量分析 | 第39页 |
| 4 讨论 | 第39-41页 |
| 第三章 分子伴侣共表达的载体构建 | 第41-48页 |
| 1 材料 | 第41页 |
| ·菌种和质粒 | 第41页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第41页 |
| ·试剂 | 第41页 |
| 2 方法 | 第41-43页 |
| ·PCR扩增Trx基因 | 第41-42页 |
| ·表达质粒pQE60-Trx的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第42页 |
| ·表达质粒pOK12-Trx的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第42页 |
| ·阳性克隆的检测 | 第42-43页 |
| 3 结果 | 第43-46页 |
| ·Trx基因的PCR扩增 | 第43页 |
| ·表达质粒pQE60-Trx的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第43页 |
| ·Trx基因表达产物的SDS-PAGE检测 | 第43-44页 |
| ·表达质粒pOK12-Trx的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第44-45页 |
| ·Trx基因和乙内酰脲水解酶基因共表达的SDS-PAGE检测 | 第45-46页 |
| 4 讨论 | 第46-48页 |
| 第四章 乙内酰脲酶的表达、纯化和激活 | 第48-69页 |
| 1 材料 | 第48-50页 |
| ·菌株和质粒 | 第48页 |
| ·培养基 | 第48页 |
| ·工具酶和试剂盒 | 第48页 |
| ·试剂 | 第48-49页 |
| ·主要溶液 | 第49-50页 |
| ·离子交换柱：DEAE Sepharose Fast Flow柱及Q Sepharose High Performance柱 | 第50页 |
| ·PCR引物 | 第50页 |
| 2 方法 | 第50-57页 |
| ·PCR扩增基因 | 第51-52页 |
| ·外源DNA与质粒载体的连接反应 | 第52页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第52-53页 |
| ·表达质粒pT221-hyuH的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第53页 |
| ·表达质粒pQE60-hyuC~D的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第53页 |
| ·表达质粒pQE60-hyuC~L的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第53-54页 |
| ·阳性克隆的检测 | 第54页 |
| ·诱导表达 | 第54页 |
| ·表达产物SDS-PAGE分析 | 第54页 |
| ·表达产物的可溶性分析 | 第54-55页 |
| ·乙内酰脲水解酶活性的检测 | 第55页 |
| ·乙内酰脲水解酶活力的测定 | 第55页 |
| ·氨甲酰化酶活性的测定 | 第55-56页 |
| ·氨甲酰化酶活力的测定 | 第56页 |
| ·氨基酸的比色测定 | 第56页 |
| ·菌体蛋白含量的测定 | 第56页 |
| ·硫酸铵沉淀 | 第56页 |
| ·透析膜的处理 | 第56-57页 |
| ·表达蛋白可溶性部分的纯化 | 第57页 |
| 3 结果 | 第57-67页 |
| ·D-乙内酰脲水解酶和D-氨甲酰化酶基因的PCR扩增 | 第57页 |
| ·表达质粒pT221-hyuH的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第57-58页 |
| ·D-hyuH基因表达产物的SDS-PAGE检测 | 第58-59页 |
| ·表达质粒pQE60-hyuC~D的构建、转化与克隆菌株的鉴定 | 第59-60页 |
| ·D-hyuC基因表达产物的SDS-PAGE检测 | 第60-61页 |
| ·BL21(DE3)／pT221-hyuH和JM109／pQE60-hyuC~D表达产物的生物活性定性分析 | 第61页 |
| ·BL21(DE3)／pT221-hyuH和JM109／pQE60-hyuC~D表达产物的生物活性定量分析 | 第61-62页 |
| ·L-hyuC基因的PCR扩增 | 第62页 |
| ·表达质粒pQE60-hyuC~L的构建、转化和克隆菌株的鉴定 | 第62页 |
| ·L-hyuC基因表达产物的SDS-PAGE检测 | 第62-64页 |
| ·L-氨甲酰化酶的纯化 | 第64-65页 |
| ·JM109／pQE60-hyuC~L表达产物的生物活性定量分析 | 第65-66页 |
| ·BT801L-乙内酰脲水解酶的激活 | 第66-67页 |
| 4 讨论 | 第67-69页 |
| 结论 | 第69-70页 |
| 英文缩写表 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-77页 |
| 接收文章 | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
