| 摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-10页 |
| 引言 | 第10-28页 |
| 1 禽流感和A型流感病毒 | 第10-17页 |
| ·禽流感 | 第10-12页 |
| ·历史 | 第10页 |
| ·现状 | 第10-11页 |
| ·临床症状 | 第11-12页 |
| ·A型流感病毒 | 第12-17页 |
| ·A型流感病毒的形态、病毒和基因组结构 | 第12页 |
| ·A型流感病毒的增殖、病毒基因组的复制和转录 | 第12-15页 |
| ·AIV和人类流感大流行的关系 | 第15-17页 |
| 2 鲍纳病 | 第17-21页 |
| ·宿主范围和临床症状 | 第17页 |
| ·BDV | 第17-21页 |
| 3 负链RNA病毒反向遗传系统研究进展 | 第21-28页 |
| ·流感病毒 | 第21-22页 |
| ·不分节段的负链RNA病毒(NNS viruses) | 第22-28页 |
| 材料和方法 | 第28-48页 |
| 1 材料 | 第28-33页 |
| ·化学试剂 | 第28-29页 |
| ·酶和酶抑制剂 | 第29页 |
| ·核苷酸和反应buffer | 第29页 |
| ·试剂盒 | 第29-30页 |
| ·细胞培养材料 | 第30页 |
| ·大肠杆菌和细胞系 | 第30页 |
| ·质粒 | 第30-31页 |
| ·血清和单克隆抗体 | 第31页 |
| ·DNA寡核苷酸 | 第31-33页 |
| ·其它材料 | 第33页 |
| 2 方法 | 第33-48页 |
| ·DNA克隆和亚克隆 | 第33-36页 |
| ·电转感受态细胞的准备 | 第33-34页 |
| ·电转 | 第34-35页 |
| ·质粒DNA的准备 | 第35页 |
| ·限制性内切酶消化 | 第35页 |
| ·DNA polymerase Ⅰ Klenow大片段补平3’末端 | 第35页 |
| ·去磷酸化 | 第35页 |
| ·酚抽提和沉淀DNA | 第35页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第35-36页 |
| ·DNA片段的准备 | 第36页 |
| ·连接 | 第36页 |
| ·质粒构建 | 第36-39页 |
| ·质粒PCR | 第36-37页 |
| ·RT-PCR | 第37页 |
| ·pPol1HHRCAT2.1#1，#2 and #3，pPol1HHRCAT2.2#1，#2 and #3 | 第37-38页 |
| ·pcDNA3.1Ribolp，pcDNA3.1Ribols-p，pcDNA3.1Ribo2 and pcDNA3.1Ribo3 | 第38页 |
| ·pPCRII-TOPO-RPA | 第38页 |
| ·pPOLIHHR-T7 | 第38-39页 |
| ·pBD-PB1，-PB2，-PA | 第39页 |
| ·pBD-NP | 第39页 |
| ·pBD-HA，-NS | 第39页 |
| ·pBD-NA，-M | 第39页 |
| ·核酶实验 | 第39-41页 |
| ·质粒线性化 | 第39-40页 |
| ·T7-转录(in vitro) | 第40页 |
| ·核酶反应 | 第40页 |
| ·变性丙希酰胺凝胶电泳 | 第40-41页 |
| ·银染 | 第41页 |
| ·真核细胞的DNA转染 | 第41-42页 |
| ·重组禽流感病毒和野生病毒的挽救、扩增和纯化 | 第42页 |
| ·氯霉素乙酰转移酶(CAT)-实验 | 第42-43页 |
| ·细胞提取物的准备 | 第42-43页 |
| ·蛋白质含量的确定 | 第43页 |
| ·CAT-Assay | 第43页 |
| ·蚀斑实验 | 第43-45页 |
| ·蚀斑实验 | 第44页 |
| ·蚀斑实验结果分析 | 第44-45页 |
| ·红细胞凝集实验(HA) | 第45页 |
| ·鸡的红细胞(RBCs)的准备 | 第45页 |
| ·HA-实验 | 第45页 |
| ·Luciferase活性实验 | 第45页 |
| ·RNase protection assay(RPA) | 第45-48页 |
| ·生物素标记探针的合成 | 第45-46页 |
| ·探针的胶纯化 | 第46页 |
| ·RNA的准备和纯化 | 第46-47页 |
| ·RNA样品与探针杂交及RNase消化 | 第47页 |
| ·保护探针的分离和检测 | 第47-48页 |
| 结果 | 第48-72页 |
| 1 AIV | 第48-59页 |
| ·pBD-PB1，-PB2，-PA，-NP，-HA，-NA，-M，-NS的构建 | 第48-49页 |
| ·检测表达聚合酶和NP基因的质粒的功能性 | 第49-51页 |
| ·挽救重组禽流感病毒 | 第51-52页 |
| ·RT-PCR鉴定重组病毒 | 第52页 |
| ·重组病毒在细胞培养的生长特性 | 第52-54页 |
| ·野生病毒FPV和重组病毒GD1NSFPV引起β-干扰素(IFN)的反应 | 第54-55页 |
| ·A／FPV／Rostock／34(H7N1)和A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)毒株的NS基因核苷酸和氨基酸序列比较 | 第55-59页 |
| 2 BDV | 第59-72页 |
| ·质粒构建 | 第59-61页 |
| ·核酶实验 | 第61-64页 |
| ·质粒构建 | 第61-63页 |
| ·核酶实验 | 第63-64页 |
| ·RT-PCR检测BDV在质粒转染的Vero(BDV感染的和未感染的Vero细胞)细胞特异的复制 | 第64-66页 |
| ·RPA检测BDV在质粒转染的Vero(BDV感染的和未感染的Vero细胞)细胞特异的转录产物 | 第66-68页 |
| ·Luciferase活性实验 | 第68-70页 |
| ·通过质粒为基础的反向遗传系统的Luciferase活性实验和CAT实验 | 第70-72页 |
| 讨论 | 第72-82页 |
| 1 AIV | 第72-78页 |
| ·建立禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)的反向遗传系统 | 第72页 |
| ·挽救重组病毒AIV | 第72-74页 |
| ·重组病毒GD1NSFPV的特性和NS基因在病毒复制中的作用 | 第74-78页 |
| 2 BDV | 第78-82页 |
| ·BDV的反向遗传系统 | 第78-79页 |
| ·产生BDV“小的基因组”新的构建 | 第79-82页 |
| 结论 | 第82-83页 |
| 1 AIV | 第82页 |
| 2 BDV | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-94页 |
| 附录 | 第94-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 简历 | 第98页 |
