| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-6页 |
| 目录 | 第6-10页 |
| 第一章 前言 | 第10-24页 |
| 1.冷激反应和低温敏感性启动子 | 第10-13页 |
| ·冷激反应 | 第10-11页 |
| ·低温敏感性启动子 | 第11-13页 |
| 2.新型细菌低温表达系统 | 第13-16页 |
| ·pCold质粒 | 第13-15页 |
| ·pCold(SP)系统 | 第15页 |
| ·pCold TF系统 | 第15-16页 |
| 3. 报告基因 | 第16-18页 |
| ·氯霉素乙酰基转移酶 | 第16页 |
| ·β-半乳糖苷酶 | 第16-17页 |
| ·荧光素酶 | 第17页 |
| ·荧光蛋白家族 | 第17页 |
| ·以抗生素kan基因为报告基因 | 第17-18页 |
| 4.人工启动子文库与构建技术 | 第18-22页 |
| ·人工启动子文库 | 第18页 |
| ·人工启动子文库的构建技术 | 第18-22页 |
| ·基于PCR引物和间隔序列的随机化设计构建人工启动子文库 | 第18-20页 |
| ·基于易错PCR构建人工启动子文库 | 第20-21页 |
| ·比较分析人工启动子文库的构建技术 | 第21-22页 |
| 5.研究目标和研究内容 | 第22-23页 |
| 6.本试验技术路线: | 第23-24页 |
| 第二章 低温敏感型启动子文库筛选方法的建立 | 第24-34页 |
| 1.材料与方法 | 第24-28页 |
| ·材料 | 第24-25页 |
| ·菌株及质粒 | 第24页 |
| ·培养基 | 第24-25页 |
| ·酶及试剂 | 第25页 |
| ·主要仪器 | 第25页 |
| ·方法 | 第25-28页 |
| ·引物设计 | 第25页 |
| ·基因的扩增 | 第25-26页 |
| ·pColdⅢ-kan质粒的构建 | 第26页 |
| ·pColdⅢ-EGFP质粒的构建 | 第26-27页 |
| ·重组质粒pcoldⅢ-kan的平板诱导表达和平板抗性检测 | 第27页 |
| ·重组质粒pcoldⅢ-EGFP的诱导表达和平板荧光检测 | 第27-28页 |
| ·荧光强度定量检测 | 第28页 |
| 2.结果 | 第28-32页 |
| ·重组质粒pColdⅢ-kan的鉴定 | 第28-29页 |
| ·以kan为报告基因检验启动子的强度 | 第29-30页 |
| ·重组质粒pColdⅢ-EGFP的鉴定 | 第30-31页 |
| ·以EGFP为报告基因平板定性检验启动子的强度 | 第31-32页 |
| ·以EGFP为报告基因定量检验启动子的表达强度 | 第32页 |
| 3.讨论 | 第32-33页 |
| 4.小结 | 第33-34页 |
| 第三章 细菌低温敏感性启动子文库的构建 | 第34-42页 |
| 1.材料与方法 | 第34-37页 |
| ·材料 | 第34-35页 |
| ·菌株和质粒 | 第34页 |
| ·培养基 | 第34-35页 |
| ·酶及试剂 | 第35页 |
| ·主要仪器 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-37页 |
| ·细菌中低温敏感性启动子的特征分析和随机引物的设计 | 第35页 |
| ·反向PCR | 第35页 |
| ·反向PCR产物的自身环化 | 第35-36页 |
| ·人工启动子文库的建立 | 第36页 |
| ·人工启动子文库的筛选 | 第36-37页 |
| 2.结果 | 第37-41页 |
| ·细菌中低温敏感性启动子的特征分析和随机引物的设计 | 第37-38页 |
| ·启动子文库的建立 | 第38-39页 |
| ·低温敏感性启动子文库的初筛 | 第39-40页 |
| ·启动子文库的复筛 | 第40页 |
| ·低温敏感性启动子的序列 | 第40-41页 |
| 3.讨论 | 第41页 |
| 4.小结 | 第41-42页 |
| 第四章 人工低温敏感性启动子的特征分析 | 第42-55页 |
| 1 材料与方法 | 第42-46页 |
| ·材料 | 第42-43页 |
| ·菌株和质粒 | 第42页 |
| ·培养基 | 第42页 |
| ·酶及试剂 | 第42-43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-46页 |
| ·启动子的冷激诱导表达 | 第43页 |
| ·荧光强度强度的定量测定 | 第43-44页 |
| ·pCSPL-129-D15、pCSPL-3-D15和pColdⅢ-D15重组质粒的构建 | 第44页 |
| ·pCSPL-129-D15、pCSPL-3-D15和pColdⅢ-D15阳性克隆的鉴定 | 第44页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第44-45页 |
| ·变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第45-46页 |
| ·质粒pCSPL-129-D15,pCSPL-3-D15和pColdⅢ-D15的表达效果检测 | 第46页 |
| 2.结果 | 第46-53页 |
| ·人工低温敏感性启动子的特征分析 | 第46-48页 |
| ·启动子的最佳诱导温度 | 第48-49页 |
| ·启动子的持续表达时间 | 第49页 |
| ·15℃时启动子的最佳诱导菌龄 | 第49-50页 |
| ·重组质粒pCSPL-129-D15,pCSPL-3-D15和pColdⅢ-D15的鉴定 | 第50-51页 |
| ·P_(129)、P_3、P_(CspA)和T7启动子表达D15基因蛋白 | 第51-53页 |
| 3.讨论 | 第53-54页 |
| 4.小结 | 第54-55页 |
| 第五章 总结 | 第55-56页 |
| 1.本研究获得的主要结果 | 第55页 |
| ·建立筛选方法 | 第55页 |
| ·通过人工启动子文库技术 | 第55页 |
| ·对强启动子P129和弱启动子P3进行了定性分析 | 第55页 |
| ·利用D15基因对启动子P_(129)和弱P_3的启动子的特征检验 | 第55页 |
| 2.本论文的创新之处 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 硕士期间发表论文目录 | 第62-63页 |
